VIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Образование бактериальной целлюлозы на средах с агропромышленнными отходами

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Гир Д.А. 1

---

1НУ"Школа"Престиж"

Савицкая И.С. 1

---

1КазНУ им. аль-Фараби

Работа в формате PDF

1.4 MB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Актуальность. Бактериальная целлюлоза (БЦ) представляет собой природный полимер, обладающий уникальными свойствами, которые отсутствуют в целлюлозе растительного происхождения. Это химически чистый внеклеточный продукт, так как он не содержит лигнина, смол, жиров и восков и поэтому не требует отбелки [1; 2]. Микрофибриллы БЦ в 100 раз тоньше микрофибрилл растительной целлюлозы, что позволяет использовать ее для создания сверхпрочных облегченных нанокомпозицонных материалов: волокон, пленок, трубок, аэрогелей, мембран оптически прозрачных композитов, в производстве бумаги, а также в качестве загустителя и стабилизатора в пищевой промышленности [3-5].

БЦ имеет высокие показатели кристалличности, обладает высокими адсорбционными и физико-механическими свойствами [6]. В связи с этим, она применяется в качестве скаффолда в тканевой инженерии, ранозаживляющих покрытиях, создании искусственной кожи при обширных ожогах, искусственных кровеносных сосудов для микрохирургии [7-9].

Наиболее известным продуцентом микробной целлюлозы является Gluconacetobacter xylinus[10]. Одной из проблем, ограничивающих получение БЦ в промышленных масштабах, является ее высокая себестоимость. Использование промышленных отходов и побочных продуктов некоторых отраслей промышленности в качестве ферментационных сред может повысить рентабельность производства БЦ. Многие исследования были сосредоточены на разработке ферментационных сред для производства БЦ, на отходах пищевой промышленности: сухого коньячного экстракта [11], фруктовых соков [12], кленового сиропа [13], сока сахарного тростника, сточных вод от производства рисового вина [14], виноградного жмыха [15], сточных вод кондитерских фабрик, мелассы, кукурузного ликера, молочной и соевой сыворотке [16].

В ряде работ для этих целей были испытаны отходы агропромышленности: пшеничная солома [17], активный ил [18], гидролизаты технической целлюлозы [19], а также отходы биодизельного производства, такие как неочищенный глицерин и побочные продукты ацетон-бутанол-этанольной ферментации [20].

Таким образом, ассортимент сельскохозяйственных и промышленных отходов, которые могли бы использоваться в ферментационных средах для роста продуцентов и образования ими БЦ, достаточно широк.

В Республике Казахстан хорошо развито молочное и сахарное производства, отходами которых являются молочная сыворотка и меласса. Один из способов их использования – разработка на их основе простых и дешевых питательных сред для получения БЦ. Помимо этого, в больших количествах имеются побочные продукты переработки злаковых культур –оболочки зерен яровой пшеницы, риса, овса, ячменя, которые после ферментативного гидролиза и осахаривания, также могут быть применены в качестве источника углерода в производственных средах для продуцентов БЦ. Плодовые оболочки – это ежегодно воспроизводимое сырье, распространенное в глобальном масштабе и имеющее нулевую себестоимость, поскольку затраты на выращивание включены в себестоимость зерна. Глицерин является один из основных компонентов органических отходов при производстве биотоплива. Значительное количество глицерина образуется при промышленной перегонке спирта в ректификационных колоннах и получении биоэтанола из растительного сырья. Утилизация отходов занимает одну из ключевых позиций в организации экологически безопасных и экономически эффективных производств. Представляется, что такой подход не только позволит удешевить себестоимость данного полисахарида, но и предлагает способ утилизации этих отходов.

Цель исследования - Подобрать питательную среду на основе сельскохозяйственных и промышленных отходов для эффективного биосинтеза БЦ в поверхностных условиях культивирования.

Задачи исследования:

1. Определить продуктивность синтеза БЦ при выращивании штамма-продуцента на средах, содержащих агропромышленные отходы.

2. Исследовать структурные и механические свойства пленок БЦ, полученной на классической и модифицированных средах с производственными отходами.

Практическая база. Исследования проводились в лаборатории биоматериалов кафедры биотехнологии КазНУ им. аль-Фараби.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Подбор питательной среды на основе сельскохозяйственных и промышленных отходов для роста продуцента и биосинтеза БЦ в поверхностных условиях культивирования

Стоимость ферментационной среды составляет 30-50% от общей стоимости целевого продукта и играет решающую роль при микробных ферментациях. Производственная питательная не только в значительной степени влияет на себестоимость получаемых материалов, но и определяет их качество. Несмотря на то, что имеется множество публикаций, с использованием дешевых источников сырья для получения БЦ, для каждого продуцента и конкретного штамма необходимо уточнять технологические параметры. Нельзя перенести оптимальные условия, выявленные для одного штамма на другой, поскольку всегда надо учитывать биосинтетические особенности конкретного продуцента.

В работе использовали новый штамм GluconoacetobacterxylinusC-3 из коллекции кафедры биотехнологии КазНУ им.аль-Фараби. Этот штамм выращивали на классической среде Hestrin-Schramm (HS), следующего состава (г\л): глюкоза – 20, гидрофосфат натрия – 2,7, пептон – 5, дрожжевой экстракт – 5, лимонная кислота – 1,15. В средах с отходами вместо глюкозы использовали молочную сыворотку (ПС-1), мелассу (ПС-2), гидролизаты оболочек злаковых культур (ПС-3). В качестве восполнителя дефицита азота в среду вносили пептон, в качестве источника витаминов – дрожжевой экстракт.

Культивирование продуцента на этих средах осуществляли в колбах стационарным способом при 29-30°С в течение 6-7 суток, после чего целлюлозу отделяли и периодически промывали 0,5-1% водным раствором NaOH при кипячении до удаления клеток. Затем целлюлозную пленку отмывали дистиллированной водой, 0,5% раствором уксусной кислоты и вновь дистиллированной водой до нейтральной реакции. Полученную целлюлозу хранили в виде гель-пленки в дистиллированной воде при 5°С. Биомассу пленок БЦ определяли после предварительного высушивания в сухожаровом термостате при 80°С до постоянной массы образца.

В таблице 1 приведены данные, отражающие результаты по определению массы пленок БЦ, образованных на средах HS, ПС-1, ПС-2 и ПС-3.

Таблица 1 – Продуктивность штамма Gluconoacetobacter xylinus C-3 на классической среде НS и средах на основе отходов

Судя по полученным данным, количество БЦ, образуемое данным штаммом на среде с молочной сывороткой сопоставимо с таковым, синтезируемом на стандартной среде НS. На среде ПС-3 с гидролизатами целлюлозы злаковых культур, используемыми в качестве источника углерода, выход полимера БЦ составил 6,89+0,01 г/л. И хотя в этих субстратах содержится примерно одинаковое количество редуцирующих сахаров (43,8 г/л в гидролизате целлюлозы и 47,4 г/л в молочной сыворотке), состав их различается. Продуцент синтезирует целлюлозу из глюкозы. Поэтому любые сахара, содержащиеся в ферментируемом субстрате, должны быть конвертированы в глюкозу. Лактоза, присутствующая в молочной сыворотке, является дисахаридом, распадающимся на глюкозу и галактозу. Галактоза считается наименее подходящим источником углерода для целлюлозообразующих бактерий [21]. Это связано с тем, что мембранный транспорт галактозы проходит неэффективно, поэтому и превращение ее в целлюлозу проходит с низким выходом [22]. Следует учесть и то, что молочная сыворотка является скоропортящимся продуктом, это является существенным недостатком широкого использования питательной среды на ее основе.

С другой стороны, учитывая высокий выход БЦ (6,89+0,01 г/л) на среде с гидролизатами зерновых оболочек, подобные среды представляются достаточно перспективными при условии наличия дешевых технологий получения гидролизатов. Такая технология разработана сибирскими учеными, где в качестве питательной среды для получения БЦ используется ферментативный гидролизат плодовых оболочек овса, мискантуса и льна [23]. Показано, что ферментативные гидролизаты являются биологически доброкачественными, пригодными для получения продуктов микробиологического синтеза и не нуждаются в дополнительной технологической обработке для освобождения их от вредных примесей [24]. Поскольку такие гидролизаты можно получать из любых возобновляемых целлюлозосодержащих растительных ресурсов, а среды на их основе использовать в разных производствах микробного синтеза, подобные разработки выглядят достаточно перспективными и с технологической, и экологической точек зрения.

Среда ПС-2 на основе мелассы является наиболее благоприятной для синтеза бактериальной целлюлозы в сравнении со стандартной средой HS и средами, содержащими отходы молочной и агро- промышленности. Выход массы полимера на среде ПС-2 составил 8,21+0,02 г/л, что в 1,8 раз больше, чем на классической среде HS (4,56+0,02 г/л). Это может быть связано с тем, в мелассе присутствует смесь углеводов (сахарозы, глюкозы и фруктозы). Первоначально продуцент расходует глюкозу, а затем постепенно и другие сахара. По аналогии с метаболизмом в организме человека, можно представить, что эти сахара обладают «низким гликемическим индексом».

Хорошо известно, что уксуснокислые бактерии, продуцирующие целлюлозу, окисляют глюкозу в глюконовую кислоту [21]. Трансформация глюкозы в глюконовую кислоту приводит к значительному снижению рН культурального бульона и блокирует синтез БЦ. При выращивании продуцента на мелассе интенсивного образования глюконовой кислоты не происходит, уровень рН остается практически на том же уровне (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Динамика синтеза бактериальной целлюлозы штаммомGluconoacetobacterxylinusС-3 на среде ПС-2

Кроме того, меласса содержит фенольные соединения, имеющие гвайацильные и сирильные звенья, сходные с лигнином [12], которые также медленно расходуются, и поэтому рН незначительно менялся, что сопровождалось усилением скорости роста клеток и образования ими БЦ. Синтез БЦ сопряжен с ростом уксуснокислых бактерий, их численность может служить маркером эффективности биосинтеза бактериальной целлюлозы.

Помимо углеводов, в мелассе присутствуют и соединения азота: некоторые аминокислоты, нуклеиновые кислоты, витамины. Их наличие освобождает от необходимости использования дополнительных источников азотного питания, таких как пептон и дрожжевой экстракт.

Однако, следует отметить, что в мелассе имеются минералы и тяжелые металлы, которые оказывают токсическое воздействие на рост микроорганизмов и синтез продукта [25]. Взвешенные примеси и тяжелые металлы мелассы могут быть удалены обработкой H₂SO₄, и Ca₃(PO₄)₂которая и была использована в работе для повышения ферментативного выхода полисахарида. Кроме того, такая предварительная обработка приводит к снижению содержания углеводов, содержание которых в нативной мелассе достаточно высоко (до 23,6 объемных %) [26], а относительно низкая концентрация сахара в мелассе (до 5 объемных %) является необходимым условием для эффективной продукции целлюлозы.

Полученные результаты свидетельствуют о том, меласса - продукт конечной стадии кристаллизации процесса производства сахара, является идеальным источником углерода для культивирования продуцента БЦ.

2. Исследование структурных и механических свойств бактериальной целлюлозы, полученной на классической и модифицированных средах с производственными отходами

Состав питательной среды может влиять на структуру БЦ. Определяющими качество этого полимера свойствами являются ее структурные особенности, обусловливающие механическую прочность. По внешнему виду полученные на разных средах гель-пленки БЦ не отличались друг от друга (Рисунок 2).

Рисунок 2 - Гель-пленки БЦ, полученные на средах с разными источниками углерода:

A – HS; B – ПС-1; C – ПС-2; D – ПС-3

Cтруктурные свойства полученных гель-пленок БЦ исследовали на растровом электронном микроскопе JSM-7800F для обнаружения возможных отличий в морфологии поверхности пленок, а также сравнения диаметра и расположения микрофибрилл полимеров относительно друг друга (Рисунок 3).

Рисунок 3 – СЭМ изображения пленок БЦ, синтезированной штаммомGluconoacetobacterxylinus С-3 на среде: А –HS; Б – ПС-1; В – ПС-2; Г- ПС-3 (увеличение х25 000)

Гель-пленки, полученные на средах с разными типами отходов, имеют взаимосвязанную пористую матричную структуру с большой поверхностной площадью. Все пленки БЦ имеют ровную и гладкую поверхность. Микрофибриллы БЦ соединяются в лентовидные волокна толщиной в одну миллионную сантиметра. Благодаря такому строению удается не только обеспечить необходимую паро- и газопроницаемость, но и удержать различные биологически активные соединения в структуре пленок.

Наличие равномерного по плотности распространения волокон каркаса БЦ обеспечивает высокую механическую прочность пленок, которая является важным показателем качества биоматериалов. Прочность пленок определяли на универсальной разрывной машине «Instron» при одноосном режиме по двум параметрам: показателю прочности на разрыв (МПа) и относительному удлинению при разрыве (%).

Таблица 2 – Механические свойства бактериальной целлюлозы, образованной на различных питательных средах

Судя по результатам, представленным в таблице 2, прочность на разрыв БЦ, образованной на стандартной средеHS составляет 17,01+0,5 МПа, а показатель удлинения – 8,01+0,7 %. Показатель удлинения (%) гель-пленок БЦ, образованных на средах ПС-1, ПС-2, ПС-3 составил 4,56+0,1; 3,28+0,2 и 6,23+0,1, соответственно.

Пленки БЦ, синтезированные на среде с мелассой, продемонстрировали высокий показатель прочности (37,12+0,2) по сравнению со «стандартными». Это значение является достаточно высоким по сравнению с механическими показателями многих плоско ориентированных слоев органических полимеров [27]. Прочность материала, синтезированного на среде с мелассой, может быть связана с возникновением водородных связей между ОН-группами целлюлозы и ОН-группами веществ в составе мелассы. Увеличение водородных связей коррелирует с высоким показателем прочности на разрыв в материале.

Стоимость 1 литра стандартной среды HSсоставляет 52 цента, среды ПС-2 на основе мелассы – 5 центов. Отсюда себестоимость 1 г БЦ на среде HS – 11 центов, а на среде ПС-2 – 0,53 цента. Таким образом, новая среда с мелассой, культивирование продуцента на которой обеспечивает высокий уровень биосинтеза БЦ, является экономически эффективной. В целом, использование сред на основе отходов пищевой и агропромышленности может значительно снизить себестоимость технологии получения не только БЦ, но и других продуктов микробиологического синтеза и открывает широкие перспективы для разработки новых технологий утилизации этих отходов.

Заключение

Подобрана питательная среда, содержащая мелассу в качестве источника углерода, обеспечивающая максимальный выход целевого продукта – БЦ при поверхностных условиях культивирования штаммаGluconacetobacterxylinusС-3. Использованиепитательной среды на основе мелассы может удешевить технологию получения БЦ.

Результаты проделанной работы позволяют сделать следующие выводы:

1. Максимальный выход БЦ - 8,21+0,02 г/л при выращивании продуцента в поверхностных условиях культивирования достигался на среде ПС-2, содержащей отход сахарного производства – мелассу.

2. Гель-пленки БЦ, образованные на классической среде HS и средах на основе промышленных отходов имели взаимосвязанную пористую матричную структуру с большой поверхностной площадью.

3. Микро- (15-35 нм) и макрофибриллы (50-150 нм) в пленках БЦ, образованных на среде ПС-2, соединяются в лентовидные волокна, обеспечивающие высокую механическую прочность (прочность на разрыв: 37,12+0,2 МПа; относительное удлинение: 3,28+0,2 %).

Список использованных источников и литературы

Nechyporchuk O., Belgacem M.N., Bras J. Production of cellulose nanofibrils: a review of recent advances // Ind. Crops. Prod. – 2016. – Vol. 93. – P. 2-25.

Gallegos A.M.A., Carrera S.H., Parra R., Keshavarz T., Iqbal H.M.N. Bacterial Cellulose: A Sustainable Source to Develop Value-Added Products: a review // BioResources. – 2016. – Vol. 11. – No. 2. – P. 1-15.

Sherif M.A.S. Bacterial cellulose production and its industrial application // J. Bioproces. Biotechniques. – 2014. – P. 2-7.

Klemm D., Schumann D., Kramer F., Hebler N., Hornung M., Schmauder H. P., Marsch S. Nanocelluloses as innovative polymers in research and application. // Adv. Polym. Sci. – 2006. –Vol. 205. – No 295. – Р. 49-96.

Shi Z., Zhang Y., Phillips GO., Yang G. Utilization of bacterial cellulose in food // Food Hydrocoll. – 2014. – No. 35. – Р. 539-545.

Kalia S., Dufresne A., Cherian B.M., Kaith B.S., Av´erousn L., Njuguna J., Nassiopoulos E. Cellulose-based bio- and nanocomposites: A Review // International Journal of Polymer Science. – 2011. – P. 1-35.

Czaja W. K.., Young D. J., Kawecki M., Brown R. M. The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications // Biomacromolecules. – 2007. – Vol. 8. - No. 1. – P. 1-12.

Amin M.C.I.M., Abadi A.G., Ahmad N., Katas H., Jamal J.A. Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties // Sains Malays. – 2012. – Vol. 41. – No. 5. – Р. 561.

Sulaeva I., Henniges U., Rosenau T., Potthast A. Bacterial cellulose as a material for wound treatment: Properties and modifications. A review // Biotechnology Advances. – 2015. – Vol. 33. – No. 8. – Р. 1547-1571.

Ruka R.D., Simon P.G., Dean K. Altering the growth conditions of Gluconoacetobacter xylinus to maximize the yield of bacterial cellulose // CSIRO Materials Science and Engineering. – 2012. – Vol. 89. – P. 613-622.

Hong F., Qiu K.Y. An alternative carbon source from konjac powder for enhancing production of bacterial cellulose in static cultures by a model strain Acetobacteraceti subsp. xylinus ATCC 23770 // Carbohydr. Polym. – 2008.– Vol. 72. – P. 545-549.

Kurosumi A., Asaki C., Yamashita Y., Nakamura Y. Utilization of various fruit juices as carbon source for production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinus NBRC 13693 // Carbohydr. Polym. – 2009. – Vol. 76.No. 2. – P. 333-335.

Zeng X., Small D.P., Wan W. Statistical optimization of culture conditions for bacterial cellulose production by Acetobacter xylinus BPR 2001 from maple syrup // Carbohydr. Polym. – 2011. – Vol. 85. – P. 506-513.

Wu J.M., Liu R.H. Thin stillage supplementation greatly enhances bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus // Carbohydr. Polym. – 2012. – Vol. 90. – No.1. – P. 116-121.

Vazquez A., Foresti M.L., Cerrutti P., Galvagno M. Bacterial cellulose from simple and low cost production media by Gluconacetobacter xylinus // J. Polym. Environ. – 2013. – Vol. 21. – No. 2. – P. 545-554.

Li Z., Wang L., Hua J., Jia S., Zhang J., Liu H. Production of nanobacterial cellulose from waste water of candied jujube-processing industry using Acetobacter xylinus // Carbohydr. Polym. – 2015. – Vol. 120. – P. 115-119.

Chen L., Hong F., Yang X.X., Han, S.F. Biotransformation of wheat straw to bacterial cellulose and its mechanism // Bioresour. Technol. – Vol. 135.– 2013. – P. 464-468.

Cavka.A., Guo.X., Tang SJ., Winestrand. S., Jönsson LJ., Hong F. Production of bacterial cellulose and enzyme from waste fiber sludge // Biotechnology for Biofuels. – 2013. – Vol. 6. – P. 25.

Guo X., Cavka A., Jönsson L.J., Hong, F. Comparison of methods for detoxification of spruce hydrolysate for bacterial cellulose production // Microb. Cell Factories. – 2013. – Vol. 12. – P. 1-14.

Huang C., Yang X.Y., Xiong L., Guo H.J., Luo J., Wang B., Zhang H.R., Lin X.Q., Chen X.D. Evaluating the possibility of using acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation wastewater for bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus // Lett. Appl. Microbiol. – 2015. – Vol. 60.– P. 491-496.

Mikkelsen D., Flanagan B.M., Dykes G.A., Gidley M.J. Influence of different carbon sources on bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus strain ATCC 53524 //J. Appl. Microbiol. – 2009. – Vol 107. –P. 576-583.

Chawla R.P., Bajaj I.B., Survase S.A., Singhal R.S. Microbial cellulose: fermentative production and applications // Food technology and Biotechnology. –2009. –Vol 47. – No. 2. –P. 107-124.

Будаева В. В., Гладышева Е. К., Скиба Е. А., Сакович Г. В. Способ получения бактериальной целлюлозы – заявка на изобретение. Регистрационный № 2015129304 от 16.07.2015.

CкибaE.A., БудaeвaВ.В., МaкaровaE.И., ПaвловИ.Н., ЗолотухинВ.Н., CaковичГ.В. Фeрмeнтaтивныйгидролизцeллюлозплодовыхоболочeковca // ВecтникКaзaнcкоготeхнологичecкогоунивeрcитeтa. – 2013. – Т.16. – № 20. – C. 195-198.

Jahan, F., Kumar V., Rawat G., Saxena R. K. Production of microbial cellulose by a bacterium isolated from fruit // Appl. Biochem. Biotechnol.– 2012. – Vol. 167. – No. 5. – P. 1157-1171.

Soher F., Mohsen M. S. A., Manal G. M., Hassan I., Ahmed A. Comparative Study for Bacterial Cellulose Production Using Egyptian Achromobacter sp. // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences.– Vol. 7. – No. 6. – 2016. – P. 954-969.

Lin, W.C., Lien, C.C., Yeh, H.J., Yu, C.M., Hsu, S.H. Carbohydrate Polymer // – 2013. – Vol. 94. – P. 603-611.