IX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Изучение взаимоотношений между диатомовыми водорослями Fragilaria radians и бактериями из озер Лабынкыр и Ворота

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Мархиева К.А. 1

---

1ЧОУ Лицей №36 ОАО "РЖД"

Захарова Ю.Р. 1Файзулаева Т.П. 2

---

1отдел ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН

2ЧОУ Лицей №36 ОАО "РЖД"

Работа в формате PDF

11.4 MB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителяСвидетельство руководителя

Введение

Данная работа является продолжением исследовательской работы «Исследование взаимоотношений между диатомовыми микроводорослями Fragilaria radians и бактериями озера Байкал» (Автор: Мархиева К., руководители: Захарова Ю.Р., Файзулаева Т.П.). В данной работе мы показали, что бактерии Bacilliusmegaterium, изолированные из донных осадков озера Байкал, угнетают рост диатомовых водорослей F.radians и способствуют деструкции кремнистых панцирей диатомей.

Озеро Лабынкыр входит в состав охраняемых природных территорий и внесено в список 26 уникальных озер Республики Саха (Якутия). Озера Лабынкыр и Ворота характеризуется факторами окружающей среды, такими как длительные периоды ледового покрова, низкая среднегодовая температура 12 – 14°С, короткий вегетационный период, низкая фотосинтетически активная радиация, ограничение биогенов. Лабынкыр и Ворота схожи по своей природе и представляют большой научный интерес, малоизучены и труднодоступны в транспортном отношении.

Альго-бактериальные сообщества являются удобной моделью для исследования трофических взаимоотношений, межвидовой коммуникации, а также взаимного подавления или кооперации.

Актуальность: диатомовые водоросли, которые продуцируют 20% органического вещества всей планеты Земля, являются основным элементом пищевой цепи в водных пресноводных экосистемах, а именно первичными продуцентами. Изучение межвидовых взаимоотношений в настоящее время занимает одно из приоритетных мест в ряду актуальных проблем современной биологии. Известно, что бактерии в природных сообществах могут, как стимулировать рост диатомовых водорослей, снабжая витаминами и продуктами минерализации труднодоступных соединений, так и подавлять их развитие. Поэтому мы продолжаем изучать взаимоотношения водорослей и микроорганизмов на данный момент и расширяем границы исследований.

Цель работы: изучить взаимоотношения организмов между аксеничной культурой Fragilariaradians и бактериями, изолированных из якутских озёр Лабынкыр и Ворота, а также определить таксономическую принадлежность некоторых штаммов бактерий.

Задачи:

Восстановить рост бактерий законсервированных штаммов из коллекции отдела ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН.

Выделить чистые культуры бактерий из данной коллекции и провести их анализ при помощи световой микроскопии.

Провести экспериментальное со-культивирование диатомеи Fragilaria radians с исследуемыми штаммами бактерий и выявить характер взаимоотношений между бактериями и F.radians.

Изучить таксономический состав бактерий, изолированных из озер Лабынкыр и Ворота методами молекулярного анализа гена 16S pРНК.

Аксеничный штамм водоросли F.radians, изолированный из озера Байкал, мы используем как модельный объект для изучения влияния микроорганизмов на кремнистые структуры панциря и динамику роста водорослей.

Гипотеза: бактерии из озёр Лабынкыр и Ворота оказывают влияние на рост и сохранность кремнистых панцирей диатомовых водорослей F.radians.

Литературныйобзор

1. Общая характеристика диатомовых водорослей

Диатомовые водоросли — микроскопические организмы, одноклеточные и колониальные. Их характерная особенность — своеобразное строение оболочки, которая представлена кремнеземным панцирем, состоящим из двух половинок, надевающихся друг на друга, как крышка на коробку (рис. 1). Большая створка называется эпитекой, меньшая — гипотекой. Под панцирем находится клетка, окруженная плазмалеммой. Ядро обычно распложено в центре клетки в цитоплазматическом мостике. Имеются вакуоли с клеточным соком.

Рис. 1. Строение панциря диатомовых водорослей:

1 - эпивальва, l a - загиб эпивальвы, 2 - поясковый ободок эпивальвы, 3 - поясковый ободок гиповальвы, 4 - гиповальва 4а - загиб гиповальвы, 5 - эпитека и гипотека, образующие панцирь, 6 - панцирь, вид с пояска, 7 - поясок, образованный несколькими поясковыми ободками.

При вегетативном размножении во время деления панцирь-коробочка раскрывается. Эпитека и гипотека расходятся и дают жизнь двум организмам, которые получают по половинке материнского панциря, и которая для дочерней особи всегда становится эпитекой (рис. 2). Гипотеку же дочерняя клетка достраивает заново. Получается, что эпитека и гипотека родителя всегда превращаются в эпитеку потомков.

Рис. 2. Вегетативное размножение диатомовых водорослей.

Класс диатомей делят на две группы — пеннатные, через створку которых можно провести две или меньше оси симметрии, и центрические, через створку которых можно провести три и больше осей симметрии. (14)

Диатомовые водоросли — наиболее распространённая в природе группа водорослей, они обитают в пресных и морских водах, особенно в планктоне морей (служат пищей животных), а также в иле на дне водоёмов, на водных растениях и подводных предметах, на сырой земле, камнях, во мху. Начиная с юрского периода известны многочисленные ископаемые диатомовые водоросли, иногда образующие мощные отложения, так называемые диатомиты, имеющие промышленное значение.

Диатомовым водорослям принадлежит доминирующая роль в глобальном круговороте кремния. Изучение процесса сохранности створок диатомовых водорослей вовремя их осаждения и разрушения представляет большой научный интерес. (5)

2. Альго-бактериальные ассоциации в природных гидробиоценозах

Формирование более или менее устойчивых альго-бактериальных ассоциаций происходит за счет того, что водоросли как естественные продуценты органического вещества служат центрами интенсивного развития микроорганизмов. Что дают друг другу партнеры в альго-бактериальных ассоциациях? Водорослям отводят центральное место в формировании бактериальных сообществ. Значение водорослей в организации альго-бактериальных ассоциаций действительно велико, их основная метаболическая функция – это продукция основного органического вещества, регуляция клеточного цикла бактерий, поддержание продолжительности жизни популяции бактерий-спутников за счет продукции биогенных элементов. В свою очередь бактериями продуцируются биологически активные вещества, витамины группы B, микроэлементы. (1)

3. Якутские озёра Лабынкыр и Ворота

Якутия – страна озер, на ее территории насчитывается более 723 тысяч озер. Среди всего многообразия озер Якутии выделяются уникальные озера, отличающиеся по своим параметрам – размерам, глубинам, историко-этнографической значимостью, богатством природных ресурсов, лечебным свойствам грязевых отложений и др., которые были отнесены к особо охраняемым территориям Якутии. Озеро Лабынкыр входит в состав охраняемых природных территорий и внесено в список 26 уникальных озер Республики Саха (Якутия). Озера Лабынкыр и Ворота ультрапресные, гидрокарбонатного класса, группы кальция, с низким содержанием биогенных элементов и органического вещества. Озера расположены среди непроходимой тайги. Ближайшее поселение Томтор находится в 105 км и отделено от Лабынкыра высокогорьями и заболоченными участками местности. Добраться до водоемов возможно только на вездеходе, лошадях или на вертолете, что создает большие трудности в их изучении. Исследование озер в зимний период осложняется экстремально низкими температурами (–50 °С). (13)

Материалы и методы

Материалы

Используемые культуры для проведения экспериментов взяты из коллекции диатомовых водорослей и коллекции штаммов бактерий из отдела ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН:

Штамм аксеничной диатомеи Fragilariaradians Ax BK 280

Штаммы бактерий из озёр Лабынкыр и Ворота (приложение 1)

Методы

Световая микроскопия

Приготовление препаратов живых клеток микроорганизмов (7)

Приготовление препаратов фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов (8)

Определение размеров клеток микроорганизмов (9)

Определение количества клеток микроорганизмов (2)

Электронная микроскопия (10)

Культивирование микроорганизмов (11)

Культивирование диатомовых водорослей (16)

Выделение чистой культуры (12)

Выделение ДНК (15)

Полимеразная цепная реакция (6, 17)

Электрофорез (3)

Метод Сэнгера (приложение 2)

Оборудование (приложение 3)

Программы для анализа видеоизображений

Toup View

xT microscope Control

Результаты

1. Восстановление законсервированных штаммов из коллекции бактерий отдела ультраструктуры клетки ЛИН СО РАН, изолированных из озер Лабынкыр и Ворота

В пробирку со штаммом на скошенном агаре добавили 10 мл 1-% пептонной воды затем поместили в термостат при Т = 24 ^оС и культивировали в течение 24 – 48 часов.

*восстановление производится в стерильных условиях.

Чашки Петри упаковали герметично по 4 штуки в крафтовую бумагу и стерилизовали в сухожаровом шкафу в течение 2 часов при температуре 180^оС. В стерильных условиях разлили рыбо-пептонный агар (РПА/10) в чашки Петри тонким слоем.

Предварительно прокалив петлю горизонтально и вертикально, взяли каплю суспензии бактерий из пробирки с пептонной водой и пересеяли штаммы бактерий на чашки Петри с РПА/10 методом истощающего штриха,

*работа производилась в ламинарном боксе в диаметре 30 см от пламени спиртовки.

Для работы было использовано 59 штаммов бактерий (приложение 1). Из них у 35 штаммов после пересева был обнаружен вторичный рост (рост грибов). Для дальнейшей работы были использованы 24 пробы без признаков вторичного роста.

24 чистых штамма бактерий повторно пересеяли для сохранения чистой культуры (таблица 1).

Таблица 1 Чистые культуры бактерий

из озер Лабынкыр и Ворота, используемые в работе

2. Изучение морфологии бактерий с использованием световой микроскопии (СМ)

2.1. Приготовление и окрашивание фиксированных препаратов чистых культур бактерий

Фиксированный препарат с бактериями готовили следующим образом:

Обработали перчатки 70%-процентным спиртом;

Зажгли спиртовку и работали в радиусе 15 см от пламени;

Автоматической пипеткой нанесли каплю культуры объемом 20 мкл на предметное стекло;

Оставили мазок на воздухе для естественного высушивания на 15-20 минут;

Провели предметное стекло над пламенем спиртовки 3-4 раза для фиксации препарата;

При помощи фуксина окрасили бактерии в течение 2-3 минут;

Смыли краситель дистиллированной водой;

Высушили препарат на воздухе в течение 10 минут.

Штаммы бактерий, приготовленные для световой микроскопии: L1m5mw7s, L1m6mw11S, L3m25ms12S, LM115S, LM116S, Lm21, Lm212, LM217, LM225, LM29, PS38, V29, V8, X7. Мазки остальных штаммов из восстановленной коллекции будут приготовлены и исследованы в ближайшее время.

2.2. Анализ препаратов исследуемых штаммов бактерий с использованием световой микроскопии (СМ)

После приготовления фиксированных окрашенных препаратов поместили их на предметный столик светового микроскопа и рассмотрели бактерии при увеличении в 1000 раз, используя иммерсионное масло. Далее, при помощи программы Toup View, сделали фотографии и установили масштабную линейку.

Было проведено микроскопирование чистых культур через 18-24 часов после посева в начале стационарной фазы роста. Выявлены одноклеточные бактериальные формы в виде палочек, палочек со спорами, кокков и тетракокков (приложение 4).

Результаты микроскопии показали, что штаммы LM217, LM225 являются смешанными культурами. Чистота штамма X7 не определяется из-за плохого качества фотографии. Следовательно, для постановки эксперимента данные штаммы бактерий не использовались. Чистые культуры, использованные для постановки эксперимента в планшетах для культивирования: L1m5mw7s, L1m6mw11S, L3m25ms12S, LM115S, LM116S, Lm21, Lm212, LM29, PS38, V29, V8.

3. Культивирование аксеничной диатомовой водоросли F.radians

Для работы были использованы диатомовые водоросли из коллекции отдела ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН. Культура Fragilariaradians была изолирована из природной популяции оз. Байкал в сезон ее доминирования в фитопланктоне в 2013 г. Протокол получения аксеничной (безбактериальной) культуры опубликован ранее (Shishlyannikov et al.). Для получения аксеничной культуры водоросли использовали сочетание методов многократного фильтрования через 5 мкм поликарбонатные фильтры, обработки детергентом Triton X-100 и антибиотиком, а также моноклонального рассева клеток.

4. Постановка эксперимента по со-культивированию диатомовых водорослей F.radians с бактериальными штаммами и учет роста диатомей

Водоросли Fragilaria radians объемом 100 мкл засеяли в 3 планшета для культивирования (размер: 4х3) по 12 лунок в каждом со средой DM (3 мл). Произвели подсчёт водорослей в каждом планшете для установления одинаковой концентрации клеток в каждой засеянной лунке.

Результаты подсчета представлены в таблице 2.

Таблица 2 Количество водорослей в планшетах (1-ый подсчёт)

В каждую пробу к чистой культуре F.radians добавили штамм бактерий. Эксперимент проводили в трёх повторностях. Также был поставлен контроль (культура без добавления бактерий: Fragilaria radians AxBK280).

Для хранения культур поддерживали постоянную температуру в течение суток (12 °С); освещенность в течение дня (14 часов) при помощи искусственного света и создавали ночной режим на 10 часов. Диатомовые водоросли культивировали в колбах Эрленмейера на среде DM при рН 6.8, содержащую (мг/л): Ca(NO₃)₂ 4H₂O – 20; KH₂PO₄ – 12,4; MgSO₄^.7H₂O – 25; NaHCO₃ – 16; Na₂ЭДТА – 2.25; H₃BO₃ – 2.48; MnCl₂^.4H₂O – 1.39; (NH₄)₆Mo₇O₂₄^.4H₂O – 1; цианкобаламин (витамин В₁₂) – 0.04; тиамин гидрохлорид (витамин В₁) – 0.04; биотин – 0.04; Na₂SiO^.5H₂O – 57. (16)

После постановки эксперимента был произведен подсчёт количества водорослей в 11 альго-бактериальных культурах и контроле:

PS38, LM29, LM116S, контроль (на 14 день эксперимента);

V8, V29, L1m5mw7s, L1m6mw11S (на 16 день эксперимента);

L3m25m512S, LM115S, Lm21, Lm212, контроль (на 23 день эксперимента).

Для оценки количества клеток F.radians, отбирали образцы по 10 мкл при помощи автоматической пипетки из каждой лунки (после тщательного перемешивания альгокультуры в среде DM через 5-6 часов после окончания темнового периода). Работу проводили исключительно в радиусе 15 см от работающей спиртовки.

После этого препарат помещали на предметный столик светового микроскопа и осуществляли подсчет количества клеток водорослей в каждой капле при стократном увеличении. Подсчет штаммов в каждой лунке проводился в трёх повторностях. Всего осуществлялось 9 подсчётов водорослей в культуре, после чего вычислялось среднее арифметическое. Результаты представлены в приложении 5.

Далее построили столбчатые диаграммы (приложение 5), где каждому штамму соответствует контроль, просчитанный в день подсчета самого штамма. Мы выяснили, что из 11 выбранных штаммов бактерий 1 штамм (V29) не оказывает влияния на динамику роста водорослей, 4 штамма (Lm21, L1m5mw7s, L1m6mw11S, LM29) угнетают рост Fragilaria radians (минимальное значение: кол-во водорослей по отношению к контролю уменьшилось в 1,3 раза; максимальное значение: кол-во водорослей по отношению к контролю уменьшилось в 6,8 раза)и 6 штаммов (L3m25ms12S, Lm212, LM115S, LM116S, Ps38, V8) стимулируют рост водорослей (минимальное значение: кол-во водорослей по отношению к контролю увеличилось в 1,2 раза; максимальное значение: кол-во водорослей по отношению к контролю увеличилось в 2,6 раза). Таким образом, было показано, что исследуемые бактерии оказывают разное влияние на динамику роста водорослей F.radians.

5. Изучение сохранности или деструкции кремнистых панцирей диатомей после проведения экспериментального культивирования

Для изучения влияния бактерий на состояние кремнистого панциря диатомовых водорослей Fragilaria radians в разных культурах были использованы методы сканирующей электронной микроскопии. После постановки эксперимента в планшетах через 24 дня альго-бактериальные культуры были зафиксированы.

5.1. Приготовление препаратов для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)

1) 11 штаммов и контроль были зафиксированы для дальнейшего изучения. 1 мл пробы зафиксировали 100 мкл 25-% глутарового альдегида до конечной концентрации раствора 2.5 % и хранили при температуре 8 °С;

2) Приготовили серию растворов спиртов по 20 мл: 30-%, 40-%, 50-%, 70-%.

Для этого рассчитывали концентрацию 96-% этилового спирта (формула 1) и воды (формула 2). Расчёт концентрации представлен в приложении 6.

При подготовке препаратов для СЭМ использовали метод обезвоживания бактериальных клеток растворами спиртов;

3) Поликарбонатные фильтры (диаметр пор: 2 мкм) были вырезаны соответственно размеру алюминиевого столика. Далее нанесли 20 мкл культур (L1m5mw7s, L1m6mw11S, LM116S, L3m25ms12S, LM115S, Lm21, LM212, контроль) на фильтр и высушили на воздухе в течение 20 минут;

4) Поместили каждый фильтр в зажим и промаркировали их;

5) Поместили зажимы на 10 минут в каждый спиртовой раствор, по возрастающей концентрации;

6) Высушили фильтры;

7) Приклеили фильтры на алюминиевые столики для СЭМ на двусторонний скотч;

8) Напылили столики золотом в вакуумной установке SDC 004 (Balzers, Лихтенштейн);

9) Проанализировали препараты на сканирующем электронном микроскопе FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США).

5.2. Анализ препаратов смешанных культур F.radians с различными штаммами при помощи СЭМ

Рассмотрели строение кремнистых структур панцирей диатомей в разных культурах с помощью микроскопа при увеличении 10⁴. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 Характер взаимодействия штаммов бактерий с Fragilaria radians

По результатам СЭМ было выявлено, что в альго-бактериальных культурах со штаммами L1m5mw7s, L1m6mw11S, L3m25ms12S, LM115S и LM212 обнаружены разрушения кремнистых структур панцирей диатомей, что указывает на способность этих бактерий снижать сохранность клеток Fragilaria radians.

В культурах штаммов LM116S и Lm21 разрушений панциря водорослей не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии отрицательных воздействий со стороны бактерий на Fragilaria radians.

В контроле все структуры кремнистого панциря были сохранены, что свидетельствует об отсутствии механического фактора и воздействий водорослей друг на друга.

Таким образом, разные штаммы бактерий по-разному ведут себя по отношению к водорослям. Некоторые образуют биоплёнки, некоторые активно колонизируют диатомеи, а некоторые колонизируют внутренние части распавшихся створок панциря.

6. Изучение таксономического состава бактерий, изолированных из озер Лабынкыр и Ворота методами молекулярного анализа гена 16S pРНК

6.1. Выделение ДНК

Для выделения ДНК были взяты 2 штамма: L1m6mw11S и LM116S (предварительно пересеянные на рыбо-пептонный агар (РПА/10) в чашки Петри). Методами световой микроскопии определяли чистоту культур (метод приготовления препаратов описан на стр.11). По результатам микроскопирования было выявлено, что выбранные культуры являются чистыми.

Клетки суточных культур снимали бактериологической петлёй с агаровых пластин (добавляли 2 мл буфера ТЕ). При помощи дозатора полученную жидкость помещали в пробирки. Биомассу промывали в 400 мкл ТЕ-буфера (20 мМ трис-HCl (рН – 8.0), 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,5 М ЭДТА), осаждали центрифугированием (MiniSpin Eppendorf) при 13400 об/мин в течение 5 минут.

К суспензии добавляли лизоцим (конечная концентрация 10 мг/мл), инкубировали 30 минут при 37°С (Микротермостат БИС). Затем добавили 50 мкл 10-% додецилсульфат натрия (ДДС) в каждую пробирку до конечной концентрации 1-% в растворе и выдерживали 10 минут при комнатной температуре. После лизиса помещали пробирки в холод (-20°С). Далее инкубировали 5 минут при 56°С (Микротермостат БИС).

Экстракцию проводили равным объёмом фенола, смеси фенол-хлороформа, хлороформа. После каждого добавления растворителя путём перемешивания добивались гомогенности суспензии и после центрифугировали при 13400 об/мин в течение 15 минут. Каждый раз отбирали растворитель и оставляли осажденные ДНК. После этого к водной фазе добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН – 4,8-5) и 2 объема 94-% этанола. ДНК осаждали в течение ночи при -20°С, затем промывали 70-% этанолом и растворяли в 100 мкл безбактериальной воды.

6.2. Постановка ПЦР (полимеразная цепная реакция)

Теоретическая часть (приложение 15)

Практическая часть

Для постановки одной реакции использовался MasterMix объёмом 10 мкл, в состав которого входит буфер, ионы магния, нуклеотиды и полимераза; вода объёмом 8,2 мкл; праймеры (forward – 27F; reverse – 1350R) объёмом 0,4 мкл каждый; ДНК объёмом 1 мкл.

*MasterMix помещали в штатив на льду (для того, чтобы полимераза не начала преждевременную работу). Все реактивы встряхиваем перед добавлением в пробирки для постановки реакции. Постановку реакции проводили в ламинарном боксе, пробирки с реакционной смесью помещали в термостат при температуре 0°С.

Было поставлено 8 реакций:

ДНК (L1m6mw11S и LM116S) – концентрации: 1:1, 1:10, 1:100 (для определения наилучшей концентрации ДНК для наработки ПЦР продукта).

Положительный контроль (ДНК – Escherichiacoli) – для проверки выделения ДНК выбранных штаммов и правильности постановки реакции.

Отрицательный контроль (H₂О) – для определения чистоты праймеров.

Далее осуществлялась постановка ПЦР в амплификаторе «БИС» М-111 («БИС-Н», Новосибирск) в следующем режиме:

1) 95°С – 15:00 минут (HOT STAR)

2

25 циклов

) 95°C – 0:30 минут (денатурация)

3) 55°С – 0:40 минут (отжиг праймеров)

4) 72°С – 1:20 минут (элонгация)

5) 72°С – 2:00 минут (финальная элонгация)

6) 4°С – поддержание температуры до извлечения продуктов ПЦР из амплификатора.

6.3. Анализ ПЦР продуктов методом электрофореза

Анализ ПЦР продуктов проводили в 1-% агарозном геле (0,5 г агарозы, 50 мл буфера ТАЕ, 1,7 мкл бромистого этидия). Полученный гель заливали в форму, устанавливали гребёнку и оставляли на 30 минут до полного затвердевания геля.

Продукты ПЦР помещали в карманы геля по 10 мкл. В первый карман поместили 4 мкл маркера (1kb DHA ladder NL001). Гель положили в камеру для электрофореза и поставили реакцию на 30 минут при напряжении 50 В и силе тока 46 мА (результаты электрофореза представлены на рис. 3).

Рис. 3. Фотография гель-электрофореза, поставленного с продуктами ПЦР.

По результатам электрофореза видно, что отрицательный контроль чистый и оптимальная концентрация ДНК для штамма L1m6mw11S: 1:10, а для штамма LM116S: 1:1.

6.4. Наработка нужного фрагмента ДНК

Далее производили наработку нужного фрагмента ДНК с помощью ПЦР.

Приготовили 8 реакций: 3 по 40 мкл (L1m6mw11S), 3 по 40 мкл (LM116S), 2 отрицательных контроля (H₂О).

Для постановки одной реакции использовался MasterMix объёмом 20 мкл; вода объёмом 16,4 мкл; праймеры (forward и reverse) объёмом 0,8 мкл каждый; ДНК объёмом 2 мкл.

Приготовили общий раствор на 8 реакций, в состав которого входил MasterMix объёмом 160 мкл; вода объёмом 131,2 мкл; праймеры (forward и reverse) объёмом 6,4 мкл каждый.

Добавили раствор в каждую пробирку (объёмом 38мкл), далее добавляли 2 мкл ДНК в нужной концентрации.

Поставили ПЦР по ранее описанному протоколу (см. стр.20).

После проведения ПЦР поставили электрофорез нуклеиновых кислот на 30 минут при напряжении 55 В и силе тока 51 мА. Маркер добавили в количестве 6 мкл.

Результаты электрофореза представлены на рис. 4:

Рис. 4. Фотография гель-электрофореза, поставленного с продуктами ПЦР.

6.5. Приготовление очищенного ПЦР продукта

Для получения чистого ПЦР продукта мы использовали набор Beckman Coulter – Agencourt AMPure XP (набор реактивов для очистки ДНК на магнитных частицах), который предназначен для очистки молекул ДНК из реакционных смесей.

Метод

Принцип метода основан на обратимом связывании ДНК на поверхности магнитных частиц, которые легко осаждаются из суспензии с помощью магнитного штатива.

Принцип действия

Магнитные частицы представляют собой парамагнитное ядро с высокоразвитой поверхностью. Поверхность покрыта полимерной плёнкой, на которой сосредоточены ковалентно-связные карбоксильные группы. Метод выделения ДНК с использованием магнитных частиц основан на двух принципах:

Способность поверхности частиц обратимо связывать молекулы ДНК;

Возможность легко осадить магнитные частицы из водного раствора при помощи магнитного поля.

В отсутствии магнитного поля частицы между собой не слипаются, но на магните происходит их моментальная иммобилизация, что позволяет быстро сменить раствор.

Протокол очистки ДНК

Достали из холодильника суспензию магнитных частиц, тщательно перемешали на вортексе. Оставили на 30 минут при комнатной температуре. По истечении времени встряхнули частицы на вортексе.

Добавили к раствору ДНК (120 мкл) 1,8 объёма суспензии магнитных частиц (216 мкл). Тщательно перемешали пипетированием. *На этом этапе происходит связывание частиц с ДНК.

Инкубировали пробирки 5 минут при комнатной температуре, в процессе инкубации пепетировали 10 раз.

Поместили пробирки в магнитный штатив и инкубировали 2 минуты, пока раствор не стал прозрачным.

Не вынимая пробирки из магнитного штатива, отобрали пипеткой прозрачный раствор, не задевая носиком массы частиц.

Не меняя положения пробирок в штативе, добавили в них 80-% этанол объёмом 200 мкл. Через 30 секунд отобрали этанол. Повторили промывание этанолом ещё один раз.

Оставили в штативе при комнатной температуре на 10 минут до полного высыхания осадка.

Добавили в пробирки 50 мкл воды, хорошо перемешали осадок пепетированием до гомогенного состояния суспензии.

Инкубировали при комнатной температуре 2 минуты.

Поместили пробирки в магнитный штатив.

Инкубировали пробирки в штативе 2 минуты, пока раствор не стал прозрачным.

Не задевая частиц, перенесли раствор очищенной ДНК в новую пробирку.

Определили концентрацию при помощи спектрофотометра BioSrectrometer (Eppendorf).

L1m6mw11S: 93, 4 мкг/мл (рис. 5).

Рис. 5. Концентрация ДНК (L1m6mw11S) в растворе (BioSrectrometer)

LM116S: 50, 1 мкг/мл (рис. 6).

Рис. 6. Концентрация ДНК (LM116S) в растворе (BioSrectrometer)

Полученные ампликоны гена 16S рРНК были отправлены на секвенирование в коллективный центр пользования «Биоинформатика» (г. Новосибирск). В результате будут получены нуклеотидные последовательности исследуемых бактерий и проведено их сравнение с последовательностями из базы данных GeneBank для определения таксономической принадлежности.

Выводы

Из коллекции законсервированных штаммов бактерий озер Лабынкыр и Ворота (коллекция была предоставлена отделом ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН) было восстановлено 24 штамма из 59. При помощи световой микроскопии была определена чистота культур бактерий, с 11 из которых было поставлено экспериментальное со-культивирование.

Данные учета численности клеток диатомей после проведения экспериментального со-культивирования Fragilaria radians и штаммов бактерий показали, что:

1 штамм (V29) не оказывает влияния на динамику роста водорослей;

4 штамма (Lm21, L1m5mw7s,L1m6mw11S, LM29) угнетаютростFragilaria radians;

6 штаммов (L3m25ms12S, Lm212, LM115S, LM116S, Lm21, Ps38, V8) стимулируют рост водорослей.

На данный момент исследование штаммов бактерий и их взаимодействие с Fragilaria radians продолжается.

При помощи СЭМ исследован характер взаимодействий бактерий и водорослей при совместном культивировании, и способность бактерий влиять на сохранность их кремнистых панцирей. 5 штаммов способствуют разрушению кремнистых структур панцирей диатомей. 2 штамма не оказывают видимых влияний на сохранность кремнистых структур панцирей. В контрольной культуре (Fragilaria radians Ax BK 280) бактерий не обнаружено, что свидетельствует о чистоте эксперимента.

Для дальнейших исследований таксономического разнообразия исследованных штаммов изучены и апробированы методы молекулярного анализа. Нами было осуществлено выделение ДНК двух штаммов бактерий: L1m6mw11S и LM116S, которые были отправлены на секвенирование в коллективный центр пользования «Биоинформатика» (г. Новосибирск). В скором времени по нуклеотидным последовательностям будет определена таксономическая принадлежность данных штаммов.

Список литературы

Глаголева О.Б., Зенова Г.Ш., Добровольская Т.Г. Взаимодействие водорослей и бактерий спутников в ассоциативных культурах // Альгология, 1992. Т. 2, № 2. С. 57 – 63.

Колотилова Н.Н., Семенов А.М. Методы количественного учёта микроорганизмов // Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов – Москва: Академия, 2005. – с. 101-102

Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Электрофорез в агарозном геле // Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук – Москва: Мир, 1984. – с.157-175.

Метод Сэнгера [Электронный ресурс], – Режим доступа: https://ru.wikipedia.org/wiki/Метод_Сэнгера. (Дата обращения: 12.02.20)

Петров Ю. Е. Диатомовые водоросли [Электронный ресурс], – Режим доступа: https://bse.slovaronline.com/11444-DIATOMOVYE_VODOROSLI. (Дата обращения: 12.12.19)

Полимеразная цепная реакция [Электронный ресурс], – Режим доступа: https://ru.wikipedia.org/wiki/Полимеразная_цепная_реакция. (Дата обращения: 10.02.20)

Семёнов А.М., Цавкелова Е.А, Юдина Т.Г., Богданов А.Г. Изучение морфологии и цитологии микроорганизмов // Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов – Москва: Академия, 2005. – с. 70-71

Семёнов А.М., Цавкелова Е.А, Юдина Т.Г., Богданов А.Г. Изучение морфологии и цитологии микроорганизмов // Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов – Москва: Академия, 2005. – с. 71-73

Семёнов А.М., Цавкелова Е.А, Юдина Т.Г., Богданов А.Г. Изучение морфологии и цитологии микроорганизмов // Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов – Москва: Академия, 2005. – с. 73-74

Семёнов А.М., Цавкелова Е.А, Юдина Т.Г., Богданов А.Г. Изучение морфологии и цитологии микроорганизмов // Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов – Москва: Академия, 2005. – с. 88-92

Семенова Е.В. Составление сред и культивирование микроорганизмов // Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов – Москва: Академия, 2005. – с. 31-44

Татаринова Н.Ю., Захарчук Л.М. Выделение чистых культур микроорганизмов // Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов – Москва: Академия, 2005. – с. 96-100

Томберг И.В., Копырина Л.И., Бессудова А.Ю., Фирсова А.Д., Башенхаева М.В., Захарова Ю.Р., Горина Е.О. Гидрохимия и фитопланктон озер Лабынкыр и Ворота (Республика Саха) // Озера Евразии: проблемы и пути их решения. 11–15 сентября 2017 г. г. Петрозаводск, Республика Карелия, Россия. – 2017. – С. 426-432.

Халиуллина Л.Ю. Альгология: Учебное пособие – Казань : ИПК «Бриг», 2018. – с. 6-8.

Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms / J. Marmur// J. Mol. Biol. – 1961. – V.3, №2. – p. 208-218.

THOMPSON A.S., RHODES J.C., PETTMAN I., 1988. Culture collection of algae and protozoa, catalogue of strains. Freshwater Biological Association, Ambleside, Cumbria.

Zakharova Y. R. The structure of microbial community and degradation of diatoms in the deep near-bottom layer of Lake Baikal / Y. R. Zakharova, Y. P. Galachyants, M. I. Kurilkina, A. V. Likhoshvay // PLoS ONE. – 2013a. – V. 8, №4 – P. 1030-1034.

Приложение 1 «Штаммы бактерий из озёр Лабынкыр и Ворота, взятые для восстановления из коллекции отдела ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН»

Таблица 1 59 штаммов бактерий из озёр Лабынкыр и Ворота

Приложение 2 «Метод Сэнгера»

Секвенирование ДНК - определение последовательности четырех химических структурных блоков - так называемых «азотистых оснований» – которые составляют молекулу ДНК. 

Процесс, используемый для секвенирования ДНК, известен как метод обрыва цепи или метод Сэнгера. Он основан на модифицированной форме полимеразной цепной реакции.

Принцип метода

В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой. Реакцию с одной и той же матрицей проводят в четырёх разных пробирках, каждая из которых содержит:

праймер — небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно отсеквенировать. Праймер необходим потому, что ДНК-полимеразы не могут начинать синтез цепи «с пустого места», они только присоединяют следующий нуклеотид к уже имеющейся 3'-гидроксильной (OH) группе предыдущего. Праймер, таким образом, представляет собой «затравку» при синтезе ДНК;

четыре стандартных дезоксинуклеотида (dATP, dGTP, dCTP и dTTP);

небольшое количество (в концентрации 1 к 100) одного из радиоактивно меченных дезоксинуклеотидов, который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции;

У дидезоксирибонуклеотидов (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) отсутствует 3'-гидроксильная группа, поэтому после их включения в цепь дальнейший синтез обрывается. Таким образом, в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом. После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и проводят авторадиографию гелей. Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК.

Современное состояние

На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано и проводится на специальных приборах, секвенаторах. Использование дидезоксинуклеотидов с флуоресцентными метками с разными длинами волн испускания позволяет проводить реакцию в одной пробирке. Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом в растворе, фрагменты ДНК, выходящие из капиллярной колонки, регистрируются детектором флуоресценции. Результаты анализируют с помощью компьютера и представляют в виде последовательности разноцветных пиков, соответствующих четырём нуклеотидам. (4)

Приложение 3 «Оборудование, используемое в работе»

Алюминиевые столики

Амплификатор «БИС» М-111 («БИС-Н», Новосибирск)

Бактериологическая петля

Вакуумная установка SDC 004 (Balzers, Лихтенштейн)

Вортекс V-1 plus (BioSan)

Дозаторы на 10-1000 мкл

Зажимы

Иммерсионное масло

Инкубатор для культивирования диатомовых водорослей

Колбы и пробирки

Краситель фуксин

Крафт-бумага

Ламинарный бокс

Магнитный штатив (Invitrogen)

Микротермостат БИС

Набор реактивов для очистки ДНК на магнитных частицах Agencourt AMPure XP

Оптический световой микроскоп Axiostar plus (Zeiss, Германия)

Оптический световой микроскоп Axiovert 200 (Zeiss, Германия)

Планшеты для культивирования

Поликарбонатные фильтры (D_пор=2 мкм)

Предметные стёкла

Пробирки эппендорф

Рыбо-пептонный агар (РПА/10)

Серия спиртов (30-%, 40-%, 50-%, 70-%)

Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США)

Спектрофотометр BioSrectrometer (Eppendorf)

Спиртовка

Среда DM для культивирования диатомовых водорослей

Среда для получения суточной культуры бактерий (1-% пептонная вода)

Сухожаровый шкаф

Термостат

Центрифуга MiniSpin Eppendorf

Чашки Петри

Приложение 4 «Морфология бактериальных штаммов изолированных из озёр Лабынкыр и Ворота, используемых в исследовании (световая микроскопия)»

Таблица 1 Фотографии 14 штаммов бактерий из озер Лабынкыр и Ворота

Приложение 5 «Численность клеток Fragilaria radians в 11 экспериментальных культурах»

Таблица 1 Подсчёт водорослей в каждой культуре

Рис. 1 Численность клеток диатомей в контроле (F. radiansAx BK 280) и альго-бактериальных культурах со штаммами L3m25ms12S, LM115S, Lm21, Lm212, V8, V29.

Рис. 2 Численность клеток диатомей в контроле (F. radians Ax BK 280) и альго-бактериальных культурах со штаммами L1m5mw7s, L1m6mw11S, PS38, LM29, LM116S.

Приложение 6 «Расчёт концентрации для серии растворов спиртов»

Таблица 1 Расчёт концентрации для серии спиртов

Приложение 7 «Препарат водоросли F. radians со штаммом L1m5mw7s (сканирующая электронная микроскопия)»

Рис. 1 Фотографии F. radians со штаммом L1m5mw7s

(Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США), xT microscope Control)

Приложение 8 «Препарат водоросли F. radians со штаммом L1m6mw11S (сканирующая электронная микроскопия)»

Рис. 1 Фотографии F. radians со штаммом L1m6mw11S

(Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США), xT microscope Control)

Приложение 9 «Препарат водоросли F. radians со штаммом LM116S (сканирующая электронная микроскопия)»

Рис. 1 Фотографии F. radians со штаммом LM116S

(Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США), xT microscope Control)

Приложение 10 «Препарат водоросли F. radians со штаммом L3m25ms12S (сканирующая электронная микроскопия)»

Рис. 1 Фотографии F. radians со штаммом L3m25ms12S

(Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США), xT microscope Control)

Приложение 11 «Препарат водоросли F. radians со штаммом LM115S (сканирующая электронная микроскопия)»

Рис. 1 Фотографии F. radians со штаммом LM115S

(Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США), xT microscope Control)

Приложение 12 «Препарат водоросли F. radians со штаммом Lm21 (сканирующая электронная микроскопия)»

Рис. 1 Фотографии F. radians со штаммом Lm21

(Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США), xT microscope Control)

Приложение 13 «Препарат водоросли F. radians со штаммом LM212 (сканирующая электронная микроскопия)»

Рис. 1 Фотографии F. radians со штаммом LM212

(Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США), xT microscope Control)

Приложение 14 «Препарат водоросли F. radians в аксеничной культуре (сканирующая электронная микроскопия)»

Рис. 1 Фотографии F. radians в аксеничной культуре AxBK 280

(Сканирующий электронный микроскоп FEI Company Quanta 200 (FEI Company, США), xTmicroscopeControl)

Приложение 15 «Полимеразная цепная реакция»

Теоретическая информация

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в пробе.

Проведение ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК.

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофильных бактерий.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (рис.1):

Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 95°C на 30 секунд, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 15 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура плавления праймеров. Время стадии отжига — 40 секунд.

Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5'- к 3'-концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 2 минуты. (6)

Рис. 1. Схема ПЦР (полимеразной цепной реакции).