IX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Идентификация бета-лактамных препаратов
Автор работы награжден дипломом победителя I степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Актуальность исследования. В настоящее время бета-лактамные антибиотики составляют основу современной химиотерапии. Они занимают ведущее место в лечении большинства инфекционных болезней. Это группа антибактериальных средств является наиболее многочисленной. Многообразие бета-лактамных препаратов объясняется стремлением получить новые соединения с более широким спектром антибактериальной активности, улучшенными фармакокинетическими характеристиками.
Множество ранее неизлечимых инфекционных заболеваний, таких как туберкулез, чума, азиатская холера, брюшной тиф или пневмония, в настоящее время успешно лечатся.
Когда эффективность лекарственного препарата доказана на практике, и он начинает пользоваться спросом у населения, на прилавках аптек начинают появляться фальсификаты. Ежегодный мировой оборот торговли подделками составляет, по самым скромным оценкам, от 15 до 20 миллиардов долларов США. В 2001 году в России было обнаружено 101 наименование препаратов, которые при проверке оказались сфальсифицированными. Это значит, что как минимум каждая двухсотая упаковка таблеток в России – фальсификат. К тому же подделывание лекарственных средств - это не просто обман и получение незаконной прибыли. Это ставит под угрозу здоровье и жизни тысяч людей.
В Европейской и Международной фармакопее для идентификации некоторых бета-лактамных антибиотиков используют реакции с раствором формальдегида в концентрированной серной кислоте (реактивом Марки). Ранее была предложена методика на основе хромотроповой кислоты в присутствии серной кислоты. Предложенная методика позволила определять лактамные антибиотики по окраске продуктов реакции, которая изменялась во времени. Однако этот процесс идентификации является дорогостоящим и длительным по времени. Отсюда возникает проблема по изучению методики, позволяющей идентифицировать лактамные антибиотики с использованием дешевых реактивов и в более короткие сроки.
Вышеизложенное определило тему исследования.
Цель работы заключается в изучении группы лекарственных средств бета-лактамных антибиотиков и методики определения их подлинности в медицинских препаратах на примере амоксициллина, ампициллина.
Задачи исследования:
Изучить группу лекарственных средств бета-лактамных антибиотиков.
Привести классификацию бета-лактамных антибиотиков.
Провести исследование по определению фальсификатов антибиотических лекарственных препаратов.
1. Антибиотики в научных исследованиях
В 1928 году 28 сентября Александр Флеминг совершил революцию в области медицины, открыв первый антибиотик пенициллин. С того момента началась история развития и совершенствования антибактериальных препаратов. В наше время каждый из нас хоть раз в жизни принимал антибиотики, но не каждый знает что это, из чего состоит, какое воздействие оказывается на организм и как в целом это работает.
Современное определение антибиотиков в словаре медицинских терминов [1] трактуется как: Антибиотики - (antibiotica; анти - + греч. bios жизнь) это вещества, продуцируемые микроорганизмами, высшими растениями или тканями животного организма, обладающие способностью избирательно подавлять развитие микроорганизмов или клеток некоторых опухолей.
Группа антибиотиков включает в себя десятки и сотни препаратов различной химической структуры [2]. Они отличаются друг от друга спектром и механизмом действия, происхождением, физическим и химическим составом, возможными побочными эффектами и т.д. Отсюда можно классифицировать антибиотики по нескольким признакам: по строению вещества, по молекулярному механизму действия, по спектру действия.
1.1 История открытия антибиотиков и их значение
Открытию первого антибиотика в мире предшествовало большое количество научных работ. Например, в ходе работ Луи Пастера выяснилось, что бациллы сибирской язвы погибают под воздействием некоторых иных микробов. Также Эрнест Дучесне использовал плесень, при лечении тифа у морских свинок [3].
В 1928 году 28 сентября Александр Флеминг впервые заметил антибактериальные эффекты пенициллина. Он случайно обнаружил зараженную плесенью Penicillium notatum культуру Staphylococcus aureus.
А. Флемингом был замечено, что в зоне вокруг плесени отсутствуют микроорганизмы. Выросшие на пластине грибы А. Флеминг отнёс к роду пеницилловых, а выделенное из них вещество - пенициллином. Исследуя пенициллин, учёный выяснил, что антибиотик воздействует на стафилококки, и на возбудителей, вызывающих скарлатину, пневмонию, дифтерию и менингит. Но пенициллин не мог препятствовать брюшному тифу и паратифу. В дальнейшем обнаружилось, что работать с пенициллином трудно, и он не может существовать в теле человека достаточно долго, чтобы убить болезнетворные бактерии [4].
В 1940 г. было проведено первое экспериментальное исследование, в котором была доказана высокая антибактериальная активность пенициллина в отношении стрептококковой инфекции у мышей. Фактически именно тогда был открыт первый β-лактамный антибиотик. Это сделали немецко-английский биохимик Эрнст Борис Чейн и Хоуард Уолтер Флори, английский бактериолог и патолог. Учёные пытались очистить и выделить достаточное количество пенициллина для лечения раненых, и им это удалось.
В 1941 году 15-летний подросток с заражением крови стал первым человеком, которого удалось спасти с помощью дозы нового антибиотика. Нобелевская премия по медицине и физиологии «за открытие пенициллина и его целебного воздействия при различных инфекционных болезнях» была присуждена Александру Флемингу, Флори и Чейну в 1945 году.
В 1943 году, в разгар Второй мировой войны, в Соединённых Штатах Америки поставили на конвейер массовое производство пенициллина, что спасло от гангрены и ампутации конечностей десятки тысяч американских и союзнических солдат. Если до внедрения антибиотика на фронт солдаты умирали от незначительных ран, то теперь более половины тех, у кого ранее не было шанса выжить, возвращались с фронта домой. За это пенициллин назвали «Лекарством века». Производство пенициллина также оказалось очень выгодным, после обнаружения американскими учёными плесени Penicillium Chrysogenum. Например, лечение одного случая сепсиса уменьшилось в цене с 200 до 6,5 долларов, то есть примерно в 31 раз [5].
Методы производства антибиотика быстро совершенствовались, и с 1952 года сравнительно дешёвый пенициллин стал применяться практически в мировых масштабах.
Уникальные свойства пенициллина позволили использовать его для лечения различных заболеваний и патологий: остеомиелита, сифилиса, пневмонии, горячки во время родов и инфицирования после ранений или ожогов.
Химическая структура пенициллина была описана позднее с помощью рентгеновской кристаллографии [7].
Все β-лактамные антибиотики содержат в своей структуре систему β-лактамного кольца и циклического амида. В настоящее время описано 5 соответствующих кольцевых систем: пенам, пенем, карбапенем, цефем и монобактамная структура.
Открытие и многочисленные научные работы и исследования, связанные с пенициллином, дали мощный толчок для развития фармакологии и изобретения новых лекарственных препаратов. Внедрение пенициллина, а за ним множества новых антибиотиков позволило продлить среднюю продолжительность жизни человека примерно на 30 лет.
1.2 Строение бета-лактамных антибиотиков
Бета-лактамы – являются одной из самых применяемых групп противомикробных лекарственных средств в клинической практике и занимают ведущее место в лечении большинства инфекционных заболеваний.
Основой молекулы β-лактамных антибиотиков является бета-лактамное гетероциклическое кольцо, состоящее из трёх атомов углерода и одного атома азота [6]. Простейшим представителем данного класса антибиотиков может служить азотистый четырёхчленный гетероцикл азетидин-2-OH, структурная формула которого приведена ниже (Рис.1).
Рисунок 1.- Структурная формула простейшего β-лактамного антибиотика - азетидин-2-OH.
Термин «лактам» означает циклическое производное кислородосодержащих (карбоновых или минеральных) кислот, в которых гидроксильная группа кислотного остатка заменена на аминогруппу NH. Количество атомов в цикле указывается с помощью префиксов, например β-лактам (4-членный бета), γ-лактам (5-членный гамма), δ-лактам (6-членный цикл дельта), структурные формулы которых приведены на рисунке 2.
Рисунок 2.- Структурные формулы: β-лактам, γ-лактам, δ-лактам.
Термин «Бета» значит, что при гидролизе, когда лактамное кольцо разрывается по наиболее неустойчивой связи, то есть между аминогруппой NH и карбонилом C=O, образуются бета-аминокислоты, у которых аминогруппа находится на втором (β) от карбоксильной группы атоме углеродной цепочки. К данному классу относятся пенициллины, карбопенемы и цефалоспорины.
1.3 Строение пенициллинов
Пенициллины, общая структурная формула которых представлена ниже и (Рис. 3) в основе своего строения несут 6-аминопенициллановую кислоту (6-АПК).
Рисунок 3.- Общая структурная формула пенициллинов.
Аминопенициллановая кислота, в свою очередь, представляет собой гетероциклическую систему, состоящую из 2 конденсированных колец: четырехчленного-бета-лактамного и пятичленного-тиазолидинового. Аминопенициллановую кислоту также называют ядром молекулы пенициллина. Отличаются пенициллины друг от друга лишь строением боковой цепи - ацильным остатком RCO- у аминогруппы 6-АПК. Названия пенициллинов производят от названий их радикалов [7].
Бета-лактамное кольцо является решающим звеном в терапии бактериальных инфекционных заболеваний. Кольцо, раскрываясь под действием ферментов (бета-лактамаз), кислот или щелочей, способно препятствовать выработке бактериями особого биополимера пептидогликана, который необходим для построения клеточной оболочки. Таким образом, мембрана вируса не может сформироваться, и микроорганизм погибает. При этом на клетки организма-хозяина разрушительного воздействия не оказывается, ведь пептидогликана в них нет.
1.4 Получение бета-лактамных антибиотиков
Первой задачей при биосинтезе пенициллина является получение соответствующего штамма - Penicillium chrysogenum (Рис. 4).
Рисунок 4.- Пеницилл золотистый
Пеницилл золотистый (лат. Penicíllium chrysógenum) — вид несовершенных грибов, который относится к роду Пеницилл (Penicillium). Он является эффективным продуцентом антибиотика, пригодного для промышленного производства. В настоящее время в промышленных условиях получают культуральные жидкости с содержанием пенициллина более 15000 ед/мл, а отдельные штаммы способны синтезировать антибиотик в количестве до 25 тыс. ед/мл. Далее производят биосинтез антибиотика, осуществляют его выделение и очистку. Затем происходит концентрирование, стабилизация антибиотика и получение готового продукта.
Также были предприняты попытки осуществить химический синтез молекулы пенициллина. Это удалось сделать в 1957 году ученому Шихену, который смог синтезировать синтетический пенициллин (феноксиметилпенициллин), а затем и усовершенствовать метод для получения эффективного в практике пенициллина – фенилпенициллина. Схема реакции Шихена представлена на рисунке 5. [8]
Рисунок 5. – Получение фенилпенициллина.
2. Методика определения фальсификации бета-лактамных антибиотиков
Так как среди антибиотиков на основе пенициллина существует огромное количество зарубежных и отечественных аналогов препарата, выпускаемых в различных лекарственных формах, то есть вероятность фальсификации лекарственного средства.
Для того чтобы выявить наличие или отсутствие фальсификации в бета-лактамном антибиотике, был выбран метод определения пенициллинов при помощи солей меди [9]. Данная методика является относительно простой в исполнении, так как она не требует сложного оборудования и дорогих реактивов.
Метод основан на различии в кислотно-основных свойствах пенициллинов, и их способности к образованию комплексных солей с ионами металлов. Реакция сопровождается явным изменением цвета раствора и осуществляется за счёт разрыва β-лактамного цикла в структуре 6-аминопенициллановой кислоты. При разрыве кольца происходит образование медной соли гидроксамовой кислоты (осадок зелёного цвета). Реакция представлена на рисунке 6. В результате эксперимента раствор подлинного препарата изменит свою окраску. Если же изменения окраски после соединения двух растворов не наблюдается, то препарат является сфальсифицированным, так как там не произойдёт разрыва β - лактамного цикла.
Рисунок 6.- Общая схема цветной реакции пенициллинов с солями меди.
Для проведения исследования были взяты 3 образца лекарственных препаратов группы пенициллинов, содержащие 6-аминопенициллановую кислоту: образец №1 (действующее вещество амоксициллин), образец №2 (действующее вещество ампициллин) и образец №3 (действующее вещество амоксициллин). Согласно проведенному опросу эти лекарственные препараты наиболее востребованы среди населения.
Для определения содержания бета-лактамного цикла был приготовлен водный раствор сульфата меди (II) с концентрацией иона Cu2+ 0,1 моль/л.
Процесс подготовки растворов исследуемых антибиотиков имел следующую последовательность: в 25 мл дистиллированной воды растворили навеску лекарственной формы, содержащую 0,5 г антибиотика. Все растворы при этом имели помутнение.
Полученные растворы выдерживали в течение 30 минут. Затем проводился процесс фильтрации. В результате мы получили прозрачные растворы антибиотиков с концентрацией 0,045 моль/л (Рис.7).
Рисунок 7.– Полученные растворы образца №1, образца №2 и образца №3 после фильтрации.
К полученным растворам исследуемых антибиотиков прилили по 10 мл раствора соли сульфата меди (II) (Рис. 8).
Рисунок 8.- Изменение окраски исследуемых растворов после добавления сульфата меди (II).
Далее проводилось сравнение всех исследуемых объектов с контрольным раствором сульфата меди (II) с концентрацией иона Cu2+ 0,1 моль/л по истечению 30 минут (Рис. 9).
Рисунок 9.- Результат исследования по истечении 30 минут времени.
Результаты эксперимента по истечению 30 минут показали, что наиболее интенсивное изменение окраски раствора произошло в стакане 2. С меньшей интенсивностью этот процесс происходил в третьем. И практически ни каких изменений не произошло в стакане под номером 1. Дальнейшее исследование проводилось по истечении 60 минут. Результат исследования представлены на рисунке 10.
Рисунок 10.–Результат исследования по истечению 60 минут.
Результаты показали, что через 60 минут интенсивность окраски исследуемых растворов продолжала усиливаться по сравнению с контрольным раствором. Интенсивно-зелёная окраска была отмечена в стакане 2, сине- зелёная в стакане 3 и незначительное окрашивание в стакане 1.
По интенсивности окраски и сравнению их с контрольным раствором были сделаны следующие выводы: в исследуемом образце №2 изменение окраски наиболее интенсивное, что свидетельствует о разрушении бета-лактамного цикла после проведения реакции с сульфатом меди (II). Следовательно, в этом лекарственном препарате концентрация 6-аминопенициллановой кислоты высокая. Бледно-зелёная окраска раствора в стакане 3 свидетельствует о сравнительно невысокой концентрации 6-аминопенициллановой кислоты в препарате. Незначительное изменение окраски, произошедшее в стакане 1, что доказывает низкое содержание 6-аминопенициллановой кислоты в исследуемом объекте. Это свидетельствует о фальсификации лекарственного препарата.
Результат проведённого исследования представлен с помощью таблицы №1.
Итоги работы объясняются реакцией взаимодействия продуктов гидролитического расщепления бета-лактама с соответствующим реактивом. Полученные результаты исследования показали, что наибольшее содержание β-лактамного цикла содержится в образце №2 в незначительном количестве в образце №3 и в меньшей степени в образце №1.
Результаты, полученные в ходе исследования можно объяснить не только концентрацией 6-аминопенициллановой кислоты в лекарственных препаратах, но и строением ампициллина и амоксициллина. Следует отметить, что структурная формула амоксициллина (Рис.11) отличается от ампициллина (Рис.12) наличием гидроксильной группы в структуре вещества. Это молекулярное изменение обеспечивает меньшее разрушение β-лактамного цикла, и, как следствие, менее явное изменение раствора. Возможно, поэтому образец №2 выбивается из выборки.
Рисунок 11. – Структурная формула ампициллина. Рисунок 12.– Структурная формула амоксициллина.
Таким образом, в ходе эксперимента были проверены на соответствие заявленного производителем состава три марки пенициллиновых антибиотиков: два препарата, содержащие амоксициллин (образцы под номером 1 и 3), и один препарат, содержащий ампициллин (образец №2). Так как все три исследуемых растворов антибиотиков изменили окраску раствора меди (II), то, следовательно, все они содержат 6-аминопенициллановую кислоту. Однако в большем количестве она содержится в объекте 2 и в меньшей степени в исследовательском объекте 3 и в незначительной степени в образце 1. Отсюда наиболее эффективным препаратом является образец под номером два.
Вторая часть исследования была проведена на базе Института химии СГУ имени Н. Г. Чернышевского. С целью идентификации антибиотиков в различных объектах (лекарственных препаратах, пищевых продуктах и биологических средах) в основном применяются спектрофотометрические, электрохимические, хроматографические методы анализа. Однако, эти методы не пригодны для быстрого анализа лекарственных препаратов на предмет их фальсификации. Для этих целей могут быть использованы тест-методы анализа [11].
Для проведения тест-анализа были использованы следующие реагенты и материалы: а) контрольный объект амоксициллин (амоксициллин натрия) – порошок для приготовления растворов для внутримышечного введения препарата; б) заявленные для исследования образцы №1, №2, №3.
Для проведения анализа был приготовлен раствор контрольного амоксициллина с концентрацией 0,1 моль/л с точной навеской 0, 9135г в растворе 0,01М соляной кислоты объемом 25 мл. Все растворы были приготовлены день исследования.
В ходе исследования использовалась индикаторная бумага. Для получения индикаторной бумаги (ИБ) фильтр размером 5×5см погружали на 2 минуты в свежеприготовленный реактив Фелинга и высушивали при комнатной температуре (Рис. 12). Затем приготовленную бумагу разрезали на части размером 1×1см.
Рисунок 12.- Индикаторная бумага для обнаружения 6-аминопенициллановой кислоты.
Далее на индикаторную бумагу помещали каплю анализируемого антибиотика, высушивали при температуре 95° С в течение 5-35 минут и проводили наблюдение. Если в препарате содержание 6-аминопенициллановой кислоты высокое, то окраска индикатора была более интенсивная. Результаты исследования представлены на рисунке 13.
Рисунок 13.- Результаты исследования: 1- образец №1; 2- образец №2; 3-образец №2.
Сопоставление изменения интенсивности окраски индикаторной бумаги показали, что: окраска индикатора изменилась до тёмно-коричневого цвета в образце №2. Это свидетельствует о высокой концентрации обнаружения 6-аминопенициллановой кислоты. Окраска буро-зелёного цвета образца №3 свидетельствует о незначительном содержании 6-аминопенициллановой кислоты в лекарственном препарате. Окраска индикатора бледно-зелёного цвета в образце №1, что свидетельствует о низкой концентрации 6-аминопенициллановой кислоты в данном лекарственном препарате.
Таким образом, методика визуально-колориметрического тест-анализа по обнаружению фальсификации по концентрации 6-аминопенициллановой кислоты в лекарственном препарате была проведена с использованием индикаторной бумаги. Полученная индикаторная бумага удобна в использовании и способна храниться длительное время. Она может быть применена для экспресс-определения и оценки подлинности лекарственных препаратов. При этом наблюдается прямая зависимость изменения цвета индикатора от концентрации амоксициллина в растворе, поэтому методика определения содержания 6-аминопенициллановой кислоты в антибиотиках может быть использована для определения концентрации активного вещества на долю препарата, которая была заявлена производителем. Преимуществом метода является дешевизна реагентов и быстрота получения необходимых результатов.
Результаты исследования позволили сделать вывод, что наибольшая концентрация 6-аминопенициллановой кислоты содержится в образце под номером 2, в меньшей степени в исследуемом объекте под номером 3 и в незначительном количестве под номером 1. Образец №1 в большей степени склоняется к фальсификации из-за низкого содержания 6-аминопенициллановой кислоты. Отсюда приходим к выводу, что наиболее эффективным лекарственным препаратом образец №2.
Заключение
В процессе исследовательской работы поставленные цели и задачи были выполнены. В ходе исследования были изучены история открытия лекарственных препаратов группы пенициллинов, строение, химический состав, структура, природа и способы получения антибиотиков. Изучены механизмы действия и избирательность антибиотиков на организм человека, проанализированы способы их получения. Это позволило сделать вывод, что открытие пенициллина и работа над совершенствованием препарата внесли огромный вклад для дальнейшей жизни всего человечества и значительно повлияли на ход исторических событий, особенно во время Великой Отечественной войны.
По результатам проведённого анализа информационных источников установлено, что антибиотики пенициллиновой группы имеют бета-лактамное кольцо в своем строении. Наличие бета-лактамного кольца или его отсутствие позволяет выявить количество содержания в антибиотиках бета-лактамной кислоты, проявляющей антибактериологическое воздействие и подлинность лекарственного препарата.
Методики, приведенные в исследовании, позволили определить преимущество одного лекарственного препарата над другим. Визуально-калориметрический метод также позволил определить заявленную производителем концентрацию активного вещества в лекарственном препарате.
Проведенное исследование не претендует на свою законченность. В дальнейшем планируется проведение исследований иных лекарственных бета-лактамных препаратов с целью выявления фальсификатов и совершенствование методики исследования, направленного на количественное определение по содержанию кислоты в каждом из исследовательских объектов.
Список использованных источников и литературы
Словарь медицинских терминов.- Режим доступа: http://www.deus1.com/doc-24-01.html
Антибиотики. Классификация. Механизмы действия антибактериальных препаратов. – Режим доступа: studfile.net
История открытия антибиотиков.- Режим доступа: studfile.net
История открытия пенициллина.- Режим доступа: https://sovets.net/13249-izobretatel-antibiotikov.html
Пенициллин в годы войны. - Режим доступа: krasgmu.net/blog/penicillin_istorija_otkrytija_i_primenenie_v_voennye_gody/
Бета-лактамные антибиотики.- Режим доступа: https://ru.wikipedia.org
Бета-лактамы.- Режим доступа: https://dvgmu.ru/images/data/pages/206/lJNiT5EHYKH9NOZS.pdf
Синтез пенициллинов.- Режим доступа: https://studopedia.net/3_4848_tehnologicheskaya-shema-proizvodstva penitsillina.htm
Алексеев В.Г., Лапшин С.В. Проверка пенициллинов // Научно-популярный журнал. Химия и жизнь – XXI век, №5, 2008
Косарева Д.В., Мальцева Е.М. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗЕ -ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ // Международный студенческий научный вестник. – 2016. – № 4-3.; С. 145-150.
Золотов Ю. А., Иванов В. М., Амелин В. Г. Химические тест-методы анализа. M.: Эдиториал УРСС, 2002. 304 с.
Крылов Ю. Ф., Бобырев В. М. Фармакология. М. : ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. 352 с.
Арзамасцев А. П. Фармацевтическая химия. М. : Гэотар ; Медицина, 2004. 640 с.
Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. 6-е изд. М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. 524 с.
Щетинин Е. В., Сирак С. В., Батурин В. А. Результаты мониторинга потребления противомикробных препаратов в амбулаторной практике // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2015. Т. 10, № 1. С. 80–84. DOI: 10.14300/mnnc.2015.10013
18