XX Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Идентификация и разделение аминокислот в фармацевтических препаратах методом тонкослойной хроматографии
Автор работы награжден дипломом победителя III степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Идентификация и разделение аминокислот в фармацевтических препаратах методом тонкослойной хроматографии
Широко известно, что аминокислоты являются строительными блоками всех белков организмов растительного и животного происхождения. Важная биохимическая роль и широкое применение аминокислот в фармацевтике, медицине, биотехнологии, пищевой промышленности, спортивной практике, широкий ассортимент выпускаемых на их основе коммерческих препаратов требуют разработки простых методов разделения, идентификации и количественного определения аминокислот в различных смесях [1,2].
Для этого к объектам, содержащим аминокислот, чаще всего применяют методы бумажной, тонкослойной, газовой и ионообменной хроматографии или капиллярного электрофореза, благодаря которым можно одновременно проводить и разделение, и определение составных компонентов смеси. Необходимость осуществлять контроль качества над большим разнообразием продуктов, содержащих аминокислот, способствует поиску наиболее дешёвых и быстрых методов разделения и идентификации аминокислот. К таким методам относится тонкослойная хроматография (ТСХ) [2,3].
Цели исследования: Нами изучено хроматографическое поведение аминокислот в выбранных препаратах в системе: модификатор (х): этанол: ледяная уксусная кислота: вода в соотношении х: 4,5 : 1,3 : 0,6. В качестве модификатора подвижной фазы мы использовали хлорпроизводные метана.
Материалы и методы: В качестве объектов исследования были взяты коммерческие препараты «BCАА-1000», «Элтацин» и аминокислотный комплекс «Эвалар Спорт Эксперт».
Исследуемый порошок препаратов предварительно взвешивали, измельчили и растворяли в пробирках дистиллированной водой 1-1,5 мл.
На хроматографической пластинке маркером отмечают линию старта на расстоянии примерно 8 мм от нижнего края и линию финиша на таком же расстоянии от верхнего края. При помощи микрошприца на линию старта наносили 0,4-0,6 мкл исследуемых веществ.
В камеру для хроматографии наливали 12-20 мл подвижной фазы и опускали подготовленную пластинку. Процесс хроматографирования проводили в камерах с плотно прикрытой крышкой. По достижению фронтом растворителя линии финиша, пластинку вынимали и высушивали конвективным способом при помощи фена. Хроматографические зоны исследуемых веществ обрабатывали специальным реагентом и идентифицировали по величинам Rf.
После проявления пластин, изображения сканировали и обрабатывали хроматографические зоны (Rf и площадь пятна). Производили расчёт количественных характеристик хроматографического процесса: число теоретических тарелок (N), высота теоретической тарелки (Н) [4,5].
Полученные результаты: В результате проведенных исследований были получены количественные характеристики хроматографических процессов, которые представлены в таблице 1 и 2.
Таблица 1.
Индекс удерживания (Rf) хроматографического разделения аминокислот в исследуемых препаратах в системах с этанолом.
|
Модификатор Препарат |
CH2Cl2 (Хлористый метилен) |
CHCl3 (Хлороформ) |
CCl4 (Тетрахлорметан) |
||||||||
|
36% |
47% |
50% |
56% |
36% |
47% |
50% |
36% |
47% |
50% |
||
|
БСАА+ |
Иле |
0.62 |
0.58 |
0.55 |
0.45 |
0.61 |
0.55 |
0.47 |
0.58 |
0.54 |
0.46 |
|
Вал |
0.58 |
0.51 |
0.48 |
0.42 |
0.53 |
0.47 |
0.42 |
0.57 |
0.51 |
0.44 |
|
|
Эвалар |
Лей |
0.56 |
0.52 |
0.41 |
0.35 |
0.61 |
0.57 |
0.52 |
0.59 |
0.51 |
0.43 |
|
Иле |
0.61 |
0.53 |
0.38 |
0.33 |
0.56 |
0.51 |
0.46 |
0.54 |
0.52 |
0.49 |
|
|
Тре |
0.81 |
0.77 |
0.72 |
0.63 |
0.77 |
0.71 |
0.66 |
0,73 |
0.67 |
0.62 |
|
|
Вал |
0.73 |
0.67 |
0.62 |
0.57 |
0.68 |
0.65 |
0.62 |
0.66 |
0.63 |
0.58 |
|
|
Арг |
0.21 |
0.19 |
0.15 |
0.13 |
0.15 |
0.12 |
0.11 |
0.13 |
0.11 |
0.11 |
|
|
Элтацин |
Глу |
0.7 |
0.67 |
0.64 |
0.61 |
0.68 |
0.62 |
0.54 |
0.68 |
0.65 |
0.63 |
|
Цис |
0.5 |
0.45 |
0.42 |
0.37 |
0.52 |
0.48 |
0.42 |
0.54 |
0.51 |
0.47 |
|
Таблица 2.
Количественные характеристики эффективности хроматографического разделения аминокислот в исследуемых препаратах в системах с этанолом.
|
АК |
CH2Cl2 (Хлористый метилен) |
CHCl3 (Хлороформ) |
CCl4 (Тетрахлорметан) |
|||||||
|
Rf* |
N |
H |
Rf* |
N |
H |
Rf* |
N |
H |
||
|
БСАА + |
Иле |
0.62 |
6.2 |
0.10 |
0.61 |
5.9 |
0.10 |
0.58 |
5.4 |
0.11 |
|
Вал |
0.58 |
5.4 |
0.11 |
0.53 |
4.50 |
0.12 |
0.57 |
5.2 |
0.11 |
|
|
Эвалар |
Лей |
0,56 |
6.2 |
0.10 |
0.61 |
5.76 |
0.10 |
0.59 |
5.5 |
0.11 |
|
Иле |
0,61 |
5.6 |
0.10 |
0.56 |
5.01 |
0.11 |
0.54 |
5.2 |
0.11 |
|
|
Тре |
0.81 |
6.6 |
0.15 |
0.77 |
6.5 |
0.14 |
0,73 |
6.6 |
0.13 |
|
|
Вал |
0.73 |
4.8 |
0.14 |
0.68 |
4.7 |
0.12 |
0.66 |
4.2 |
0.11 |
|
|
Арг |
0.21 |
4.5 |
0.09 |
0.15 |
4.1 |
0.11 |
0.13 |
4.1 |
0.09 |
|
|
Элтацин |
Глу |
0.7 |
7.8 |
0.09 |
0.68 |
7.3 |
0.09 |
0.68 |
7.4 |
0.09 |
|
Цис |
0.5 |
4.1 |
0.13 |
0.52 |
4.3 |
0.12 |
0.54 |
4.7 |
0.11 |
|
Rf* - взяты усредненные значения
На рисунках представленных ниже, показаны графические зависимости индекса удерживания аминокислот в исследуемых препаратах от изменения концентрации модификатора подвижной фазе.
Рис. 1. Графическая зависимость индекса удерживания аминокислот в исследуемых препаратах от изменения концентрации хлористого метилена и хлороформа.
Р
Рис.3. Пример хроматограммы разделения аминокислот в препарате ВСАА-1000
ис. 2. Графическая зависимость индекса
удерживания аминокислот в исследуемых
препаратах от изменения концентрации
тетрахлорметана.
Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о достаточно уверенном разделении аминокислот практически во всем диапазоне взятых концентраций модификаторов. Особенно уверенное разделение аминокислот наблюдается при средних концентрациях хлористого метилена и хлороформа. Наилучшее разделение отмечено в системах с хлористым метиленом в диапазоне концентраций 36%-47%. В случае же с хлороформом, наилучшее разделение аминокислот наблюдается в диапазоне 50-56%. В системах растворителей, где модификатором являлся тетрахлорметан полного разделения всех исследуемых аминокислот не наблюдалось. Тем не менее, разделение большинства из них наблюдалось при пониженных концентрациях. Так же следует отметить, что размер пятна и его компактность также зависела от концентрации модификатора: при пониженных концентрациях в диапазоне (36-47%) пятна были наиболее компактные и не имели хроматографических «хвостов».
По результатам исследований можно сделать следующие выводы:
1) Проведен хроматографический анализ аминокислот, входящих в состав 3-х коммерческих препаратов (BСАА-1000, Эвалар, Eltacin).
2) Представлен расчет количественных характеристик хроматографического разделения аминокислот при выбранных условиях эксперимента.
3) Построены графические зависимости индекса удерживания аминокислот от различных концентраций модификаторов в элюентах с этанолом.
4) Выявлены подвижные фазы с оптимальным интервалом концентраций модификаторов, при которых наблюдается полное или частичное разделение аминокислот в данных препаратах
5) Полученные результаты могут быть использованы для идентификации и разделения аминокислот в различных смесях природного и искусственного происхождения.
Список литературы:
1. Кирхнер. Ю. Тонкослойная хроматография в 2 ч. Кн.1 -М.:Мир, 2011.-652 с.
2. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты. Пептиды и Белки.-М.: Мир, 2010. -362 с.
3. Ленинджер А. Биохимия: молекулярные основы структуры и функций клетки.: Пер. с англ. М. 2020. –703 с.
4. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч.. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. -М.: Мир, 4.1, 2010. -450 с.
5. Шталь Э., Хроматография в тонких слоях. -М.: Мир, 2005.- 750 с.