V Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Идентификация и количественное определение флавоноидов в составе некоторых лекарственных растений.

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Газизова Н.М. 1

---

1Филиал "Назарбаев Интеллектуальная школа физико-математического направления г.Семей"

Динжуманова Р.Т. 1

---

1Государственный университет имени Шакарима города Семей

Работа в формате PDF

856.6 KB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Актуальность исследования. Лекарственные средства растительного происхождения нашли широкое применение в современной фармакотерапии. Одним из важнейших классов соединений, содержащихся в лекарственном растительном сырье, являются флавоноиды. Интерес к флавоноидам велик ввиду присущего им широкого спектра биологического действия и антиоксидантной активности. Многочисленные исследования показывают, что препараты, созданные на основе этих веществ, являются высокоэффективными противоопухолевыми средствами, обладают антиоксидантными свойствами, снижают риск заболеваний сердечно-сосудистой системы и могут успешно использоваться при лечении различных заболеваний внутренних органов: эти вещества зачастую проявляют бóльшую эффективность, чем известные лекарственные препараты [1-4].

В настоящее время для идентификации и количественного определения флавоноидов в лекарственных средствах широко используются физико-химические методы анализа, такие как спектрофотометрия, абсорбционная спектроскопия. Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) является наиболее доступным и объективным методом контроля флавоноидов в растительном сырье, так как флавоноиды обладают различной растворимостью, сорбционной способностью и возможностью давать различные цвета с хромогенными реактивами при УФ-облучении.

Объект исследования: лекарственныерастения - ромашка, зверобой, шелуха лука, чертополох.

Предмет исследования: анализ содержания флавоноидов в лекарственных растениях (ромашка, зверобой, шелуха лука, чертополох) методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрическим методом.

Цель научной работы. Качественное и количественное определение флавоноидов в лекарственных растениях методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрическим методом.

Задачи научной работы:

1.Изучить современные методы выделения и идентификации флавоноидов и выявить особенности (строение, физические и химические свойства) природных флавоноидов как объектов исследования;

2. Изучить теоретические вопросы анализа флавоноидов в лекарственных растениях методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометри;

3. Провести качественное и количественное определение флавоноидов в растительном сырье: ромашке, зверобое, шелухе лука и чертополохе методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии;

4. Сделать выводы об эффективности использованных методов для определения флавоноидов.

Степень изученности данного вопроса: На сегодняшний день ромашка, зверобой, шелуха лука и чертополох являются перспективными лекарственно-техническими культурами, поэтому необходимо более детальное изучение ее состава. В научной литературе имеется значительное количество публикаций, касающихся применения этих растений при лечении различных заболеваний и химическом составе. Однако в литературе практически отсутствуют данные о процентном содержании кверцетина в данных культурах. А кверцетин, также как и рутин, является одним из значимых флавоноидов для организма человека.

Итак, в качестве пути решения данной проблемы можно предложить использование тонкослойной хроматографии и спектрофотометрического метода, так как они являются наиболее доступными и объективными методами контроля биологически активных соединений в растительном сырье и суммарных фитохимических препаратах. А также, использование этих методов анализа позволяет идентифицировать отдельные флавоноиды, не зависимо от присутствия посторонних или родственных соединений.

Характеристика личного вклада автора работы в решение избранной проблемы: автор провела литературный обзор по предмету исследования, выполнила экспериментальную часть проекта под наблюдением руководителя, самостоятельно выполняла химические расчеты, обработку результатов и тщательно изучила пути решения проблем. Ученица показала себя как инициативный, творчески мыслящий исследователь с научным интеллектом и эрудицией в области знаний по химии, биологии. Она успешно решала поставленные перед ней задачи экспериментальной части работы, а именно, получила достоверные данные по анализу объектов исследования. Ее правильная реакция на замечания научного руководителя свидетельствует о взыскательности и требовательности исследователя к себе и своим трудам. Результаты работы были апробированы на городских и республиканских научно-практических конференциях: 2-й Городской научной конференции «Шакаримовские чтения» для школьников и студентов, г.Семей, 2017 г. (сертификат и тезис); Республиканской конференции-конкурсе школьников с международным участием «Жас галым», г.Караганда, 2017 г. (диплом 2 степени, сертификат и тезис); Республиканском конкурсе лучших научных работ по химии среди учащихся средних школ, гимназий и лицеев, г. Астана, 2017 г. (диплом 3 степени, сертификат и тезис); Республиканском конкурсе Дарабоз в номинации «Лучшая научная работа», 2018 г. (диплом 1 степени, сертификат).

1. Обзор литературы

1.1 Флавоноиды

К настоящему времени установлена структура и описаны физико-химические характеристики более 7500 природных флавоноидов. Наиболее богаты флавоноидами (от 1 до 30%) растения семейств: сложноцветные (астровые), бобовые, зонтичные (сельдерейные), губоцветные (яснотковые), розоцветные, гречишные, рутовые, березовые и др. Локализуясь главным образом в цветках, листьях, плодах, в меньшем количестве - в стеблях и корнях, флавоноиды достигают максимума содержания в фазе бутонизации и цветения. Значительно реже флавоноиды встречаются в микроорганизмах и тканях насекомых [5-6]. Таким образом, флавоноиды – соединения широко распространные в природе. Примерами флавоноидов, значимых для человека являются рутин и кверцетин [4].

Рутин – органическое соединение из группы флавоноидов, обладающее витаминной активностью [3,5]. Основные функции рутина: антиоксидантные, противовоспалительные, антиканцерогенные, антитромбические, противоязвенные, антиаллергические, противоотечные, спазмолитические, сахароснижающие, желчегонное действие; уменьшение венозного отека; сдерживание агрегации тромбоцитов; защита от токсинов и др. К основным природным источникам рутина относятся: листья гречихи, листья чайного куста, черная смородина, шиповник, клюква, соки черники и рябины, можжевельник (ягоды), боярышник (бутоны), ромашка (цветы), календула [3,7].

Кверцетин является агликоном рутина. По химической структуре кверцетин представляет собой 3,5,7,3'4'-пентаоксифлавон [3,5] (рис. 1).

Рисунок 1. Химическая структура кверцетина

К основным функциям кверцетина относится: антиоксидантное, противоотечное, спазмолитическое, антигистаминное, противовоспалительное, диуретическое, противоязвенное, гипотензивное, иммуностимулирующее, противодиабетическое, гипогликемическое, противовирусное, ранозаживляющее, геропротекторное, анаболическое действия; снижение проницаемости стенок капилляров; повышение тонуса сосудов; блокада синтеза лейкотриенов и других воспалительных медиаторов; процессы ремоделирования костной ткани; эстрогено-подобное действие; нормализация выработки кортизона и инсулина; защита ЛНП-холестерина от окисления; улучшение реологии крови; угнетение синтеза тромбоксана; поддержка миокарда; стабилизация клеточных мембран; стимуляция ферментных систем; улучшение функций фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов; транспорт калия и натрия; адаптация к гипоксии; апоптоз раковых клеток.

В организме человека кверцетин, как и рутин, не вырабатывается. К основным источникам кверцетина природного происхождения относятся: брусника, черная смородина, малина, ежевика, клюква, черника, рябина, облепиха [6,7].

1.2 Экстрагирование флавоноидов из растительного сырья

Одним из главных этапов при изучении состава и получения лекарственных средств является извлечение (экстрагирование) флавоноидов. Для флавоноидных гликозидов подходящими экстрагентами являются спиртосодержащие смеси: метанол – вода и чаще этанол – вода с разным соотношением компонентов. Спиртосодержащие экстрагенты выполняют еще и важную роль ингибирования ферментных систем растений и тем самым способствуют сохранению нативности состава. В целях количественного анализа процедуру извлечения повторяют дважды или трижды (до максимального «истощения» экстрагируемого материала). Если растительный материал (листья, трава и т. п.) обогащен хлорофиллом, то для освобождения от него либо проводят преэкстракцию неполярным растворителем (хлороформом, диэтиловым эфиром), либо обрабатывают этими растворителями уже полученные экстракты, как правило, после практически полного удаления из них спирта. Наиболее часто используются избирательная экстракция, осаждение с помощью солей тяжёлых металлов и хроматографические методы [8].

1.2 Методы определения флавоноидов

Так как, наряду с кверцетином, в растительных объектах находятся и относительно большие количества индивидуальных флавоноидов, то задача селективного их выделение из сырья и последующее их определение требует применения различных методов анализа природных объектов.

В настоящее время все большее распространение получают комбинированные методы, включающие различные варианты хроматографического разделения исследуемых компонентов. Эти методы обладают значительно большей чувствительностью и селективностью по сравнению с современными химическими и электрохимическими методами.

Для разделения флавоноидов между собой и отделения от cопутствующих веществ используется адсорбционно-хроматографический метод [9].

Метод ВЭЖХ является быстрым, хорошо воспроизводимым методом, который требует малого количества анализируемого вещества и используется для количественного, качественного анализа и препаративного выделения [10].

В современной науке для обнаружения и количественного определения флавоноидов в растительном сырье также используется метод капиллярного электрофореза [11]. Преимуществами капиллярного электрофореза являются: высокая эффективность разделения, экономичность (малый расход реактивов) и экспрессивность.

Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения является одним из наиболее распространенных методов анализа флавоноидов. Обладая высокой чувствительностью, метод не селективен, так как не контролирует содержание каждого из веществ одного класса соединений [12].

Широкое распространение в анализе флавоноидов получили комбинированные методы, включающие предварительное хроматографическое разделение на бумаге, в тонком слое с последующим определением веществ в элюатах из пятен хроматограмм, а также непосредственным сканированием оптической плотности или определением площади пятна на хроматограмме [13]. В работе [14] приведена идея количественного определения флавоноидов в экстракте бузины с помощью применения масс-спектрометрии DART (Direct Analysis in Real Time – прямой анализ в реальном времени), который отличается от традиционной масс-спектрометрии тем, что позволяет обходиться без стадий пробоподготовки и хроматографического разделения.

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) очень удобен для сравнительного анализа с ис­пользованием стандартных веществ и позволяет широко варьировать сочетание сорбента и подвиж­ной фазы, подбирая наиболее оптимальный вариант для конкретного объекта.

Таким образом, в современной науке огромное внимание уделяется поиску оптимальных путей использования флавоноидов в интересах укрепления здоровья людей, профилактики и лечения различных патологий, вызванных или сопровождающихся усилением свободнорадикальных процессов окисления. На основе флавоноидов возможно создание новых высокоактивных лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительной, антиканцерогенной, противовирусной, антипаразитарной или бактерицидной активностью.

Важной особенностью флавоноидов и их производных является тот факт, что они обладают меньшей токсичностью и проявляют меньше побочных эффектов, чем аналогичные лекарственные средства, полученные из других источников. Однако даже современная медицина пока еще не расшифровала в точности механизм старения клеток и их злокачественного предупреждения. Следовательно, до настоящего времени нет четкого понимания роли свободных радикалов в данных процессах. Как флавоноиды могут влиять на преждевременное старение, развитие онкологических болезней и накопление вредных мутаций в клетках, пока является загадкой.

2. Практическая часть

2.1 Используемые реактивы, оборудование и методы исследования

Применяемые реактивы: 70% этиловый спирт, концентрированная соляная кислота, стандартный раствор кверцетина - 0,05 мг/мл, н-бутанол, 3% раствор ванилина, дистиллированная вода.

Оборудование:

1)Устройства ТСХ: «Ленхром» кабинет УФ, λ=250 – 366 нм; (рис. 2), «Ленхром» спрей-камера; (рис.3), сушильный шкаф; (рис.4), хроматографическая камера (для пластин 10x10 см); (рис.5), пульверизатор; (рис.6), пластинки "Сорбфил" (ПТСХ-П-А-УФ 10x10 см);

2)UV-VIS спектрофотометр Specord 210 Plus (Германия) (рис.7).

Методы исследования:метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), спектрофотометрический метод.

Рисунок 6. Пульверизатор

Рисунок 7.UV-VIS спектрофотометр

Specord 210 Plus (Германия)

2.2 Анализируемые объекты

Растительный материал. В качестве объекта исследования использовали шелуху лука, цветки лекарственной ромашки (лат. Matricaria chamomilla), листья и стебли чертополоха (лат. Carduus), цветки и листья зверобоя (лат. Hypericum).

2.3 Общие экспериментальные условия

1) В качестве экстракта для извлечения флавоноидов из сырья был использован 70%-ного этиловый спирт, который по литературным данным обеспечивает наибольшую полноту экстракции анализируемых растений. Полученные экстракты (рис.8-10) используют для дальнейшего анализа.

2) Для хроматографирования флавоноидов методом ТХС использовали пластинки "Сорбфил" ПТСХ-П-А-УФ (Россия) в системе н-бутанол-этанол-вода (5:3:2) и стандарстный раствор (ГСО) кверцетина 0,05 мг/мл в 70% этаноле, который готовили по точной навеске. Рабочие растворы хранили в холодильнике не более 10 дней.

3) На хроматограммах флавоноиды обнаруживали по характерному свечению в УФ-свете при длине волны 366 нм до и после обработки раствором 3%-ного ванилина (рис.11-14) [14-16].

4) Идентификацию кверцетина проводили после определения показаний Rf для стандарстного раствора (ГСО) кверцетина и анализируемых объектов. Для уменьшения значений погрешностей эксперимента определение Rf проводили три раза (табл. 1).

Рисунок 7. Лекарственная ромашка и спирто-водный раствор его экстракта

Рисунок 9. Шелуха лука и спирто-водный раствор его экстракта

.

Рисунок 10. Зверобой и спирто-водный раствор его экстракта

Рисунок 14. УФ-свет, 366 нм пятно с экстрактом шелухи лука

Рисунок 15. УФ-свет, 366 нм пятно с экстрактом зверобоя

Таблица 1. Хроматографическая характеристика кверцетина в анализированных растениях (ТСХ)

Примечание: данные показателей Rf в табл.1 представляют собой среднее значение трех определений, при этом отклонения полученных результатов не превышают 5%.

5) Для количественного определения флавоноидов в пересчете на кверцетин методом ТСХ были проведены следующие работы:

а) на аналитических весах произвели взвешивание разрезанных из пластинок пятен стандартного раствора кверцетина и анализируемого экстракта растений;

б) используя такие показатели, как масса анализируемого растения, объем полученного из него спирто-водного экстракта, среднее значение массы пытен ГСО кверцетина и пятен экстракта растений, расчитали концентрацию кверцетина в пятне экстракта растения, массу и процентное содержание кверцетина в экстракте растения (расчеты приведены ниже).

6) Количественное определение кверцетина основано на определении оптической плотности анализируемых веществ и ГСО кверцетина при определенной длине волны. При этом в присутствии AlCl₃ позволяет минимизировать вклад сопутствующих веществ в оптическую плотность исследуемых растворов. Измерив оптическую плотность растительных экстрактов на приборе UV-VIS спектрофотометр Specord 210 Plus (Германия) при длине волны 430 нм. Содержание флавоноидов в пересчете на кверцетин в процентах (%) вычисляли по формуле:

Х= ,

где D- оптическая плотность исследуемого раствора; 764,6 – удельный показатель поглощения комплекса кверцетина с алюминия хлоридом при 430 нм; m- масса сырья в граммах; W- потеря в массе при высушивании в процентах (расчеты приведены ниже).

2.4 Результаты

1. Количественное определение кверцетина в экстракте ромашки.

A) Методом ТСХ:

Вычисляем среднее значение массы пятен стандартного кверцетина m_ст:

m_ст==0,1267 г = 126,7 мг

используя значение концентрации стандартного раствора кверцетина С_ст (0,05 мг/мл) и среднее значение массы обрезанных пятен анализируемого экстракта m_x(122,6 мг), находим концентрацию кверцетина в пятне экстракта ромашки С_х, мг/мл: С_х== =0,0484 мг/мл,

по следующей формуле расчитываем массу кверцетина в составе пятна экстракта ромашки m_кв, (г):

m_кв= C_х* m_ст=0,0484 мг/мл * 126,7 мг =6,1323 мг = 0,006132 г,

затем значение массы кверцетина в пятне экстракта ромашки (m_кв) и общую массу навески растения (m), взятого изначально для анализа, подставив в следующую формулу x= находим процентное содержание кверцетина в экстракте:

x==0,1524

Данную схему количественного определения кверцетина применяем для всех анализируемых объектов исследования.

Б) Методом спектрофотометрии:

Х= = = 0,2526%

2. Количественное определение кверцетина в экстракте чертополоха.

A) МетодомТСХ: m_ст==0,1537г=153,7мг,С_х===0,0451 мг/мл

m_кв=C_х*m_ст=0,0451мг/мл*153,7мг = 6,93мг = 0,00693 г, x==0,1707

Б) Методом спектрофотометрии:

Х= = = 0,4549 %

3. Количественное определение кверцетина в экстракте шелухи лука.

A) Методом ТСХ:

m_ст==0,1341г=134,1мг ,С_х===0,0484 мг/мл

m_кв=C_х*m_ст=0,0484мг/мл*134,1мг= 6,4904 мг = 0,00649 г, x==0,1575

Б) Методом спектрофотометрии:

Х= = = 0,3670 %

4. Количественное определение кверцетина в экстракте зверобоя.

A) Методом ТСХ:

m_ст==0,1384г=138,4мг,С_х===0,0470 мг/мл

m_кв=C_х*m_ст=0,0470мг/мл*138,4мг =6,5048 мг =0,00651 г, x==0,1594

Б) Методом спектрофотометрии:

Х= = = 0,2799 %

Как видно, полученные разными методами данные по содержанию флавоноидов (кверцетина) сильно разнятся. Расчеты данных ТСХ ниже, по сравнению с данными спектрофотометрического анализа. Видимо, это связано с тем, что при проведении процесса разрезания из пластинок пятен анализируемого экстракта растений при использовании метода ТХС имеют место быть потери, так как пластинки при разрезании сильно крошатся. А использование спектрофотометрического метода анализа для количественного определения флавоноидов позволяет исключить такие погрешности.

Выводы и заключение

1) Флавоноиды - широко распрастранные природные соединения, исключительно многогранны. В равной мере они интересны как объекты изучения в ботанике, фармакогнозии, фитохимии и особенно в фармации и медицине.

2) Из литературного анализа было установлено, что наиболее доступным и объективным методом контроля биологически активных соединений в растительном сырье и суммарных фитохимических препаратах является хроматографические методы анализа, которые позволяют идентифицировать отдельные флавоноиды, не зависимо от присутствия посторонних или родственных соединений. Достоинством применения тонкослойной хроматографии как метода анализа флавоноидов в растительном сырье является относительно быстрое распределение составляющих смеси, устойчивость к агресивным индентификаторам и нагреванию.

3) Проведено качественное и количественное определение флавоноидов в пересчете на кверцетин в спирто-водных экстрактах некоторых лекарственных растений методом ТХС и спектрофотометрии. Процентное его содержание составило: в ромашке - 0,1524% и 0,2526%; чертополохе - 0,1707% и 0,4549%; шелухе лука – 0,1575% и 0,3670%; зверобойе – 0,1594% и 0,2799% соответственно. На основе анализированных лекарственных растений возможно создание новых высокоактивных лекарственных препаратов, потенциально обладающих противовоспалительной, антиканцерогенной, противовирусной, антипаразитарной и бактерицидной активностью. Эти вещества могут проявить бóльшую эффективность, чем известные лекарственные препараты.

4) Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) и спектрофотометрии очень удобен для сравнительного анализа флавоноидов с ис­пользованием стандартных веществ и позволяет широко варьировать сочетание сорбента и подвиж­ной фазы, подбирая наиболее оптимальный вариант для конкретного объекта.

Список использованныхисточников и литературы:

1. Tsao R.,Deng Z. Separation procedures for naturally occurring antioxidant phylochemicals.//J.Chromatogr. B. – 2004. – V.812. – № 1-2. – Р.85-99.

2. Andersen O.M., Markham K.R. Flavonoids: chemistry, biochemistry and applications. Boca Raton: Taylor & Francis Group. LLC. – 2006. – 1212 p.

3. Биологически активные вещества растительного происхождения / Б.Н. Головкин, Р.Н. Руденская, И.А. Трофимова – М.: Наука, 2002.

4. Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музычкина Р.А., Толстиков Г.А. Природные флавоноиды. Новосибирск: Гео., 2007. – 232 с.

5. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия: учебник для высш.шк./ В.Г.Беликов – М.: МЕДпресс-информ, 2007. – 624 с.

6. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. – М.: Медицина, 2002.

7. Биологически активные вещества растительного происхождения / Б.Н. Головкин, Р.Н. Руденская, И.А. Трофимова, А.И. Шретер. – М.: Наука, 2002.

8. Каухова, И. Е. Особенности экстрагирования биологически активных веществ двухфазной системой экстрагентов при комплексной переработке лекарственного растительного сырья / И. Е. Каухова // Растительные ресурсы. – 2006. – Т. 42. – Вып. 1. – С. 82-91.

9. Ninfali P., Bacchiocca M., Antonelli A., Biagiotti E., Di Gioacchino A.M., Piccoli G., Stocchi V., Brandi G. Characterization and biological activity of the main flavonoids from Swiss Chard (Beta vulgaris subspecies cycla). // Phytomedicine. – 2007. – V. 14. – № 2-3. – Р. 216-221.

10. Сычев, С.Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии «Милихром»: Монография/ С.Н. Сычев, К.С. Сычев, В.А. Гаврилина. – Орел: ОрелГТУ, 2002. – 134с.

11. Абдуллабекова, В.Н. Идентификация рутина в растительном сырье методом капиллярного электрофореза/ В.Н. Абдуллабекова// Вестник фармации. – 2009. – №3. – С.23-28.

12. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа/ Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под ред. Ю.А. Золотова. – М.: Высшая школа, 2002. – 494 с.

13. Дегтярев, Е. В. Применение тонкослойной хроматографии в анализе БАВ / Е. В. Дегтярев, Б. В. Тяглов, В. Д. Красиков, А. В. Гаевский // 100 лет хроматографии. – М.: Наука, 2003. – 124с.

14. Чернецова Е.С., Морлок Г.Е., Ревельский Ч.А. Масс-спектрометрия DART и ее применение в химическом анализе//Успехи химии. – 2011. –№80(3). – С.249-271

15. Дегтярев, Е. В. Применение тонкослойной хроматографии в анализе БАВ / Е. В. Дегтярев, Б. В. Тяглов, В. Д. Красиков, А. В. Гаевский // 100 лет хроматографии. – М.: Наука, 2003. – 124с.

16. Кирхнер, Ю. В. Тонкослойная хроматография / Ю. В. Кирхнер. – М.: Мир, 1981. – 542с.

17. Тихонов Б. Б. Комплексная экстракция гликанов и флавоноидов из растительного сырья // Вестник ТвГТУ. — 2011. — Т. 128, вып. 19. — С. 57—63.

18. Бекетов Е. В. Идентификация и количественная оценка флавоноидов в плодах черемухи обыкновенной/ А. А. Абрамов, О. В. Нестерова // Вестник Московского университета. Химия. 2005. Т. 46, № 4 С. 259–262.

19. Куркина А.В. «Состав и содержание флавоноидов в листьях» / Загоскина Н.В., Рязанова Т.К. // Растительные ресурсы, 2013.-410-415 c.