V Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

ФЛАВОНОИДЫ В СОСТАВЕ НЕКОТОРЫХ ПЛОДОВО-ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Сиязбаева М.М. 1

---

1НИШ ФМН г.Семей

Динжуманова  Р.Т. 1

---

1ГУ имени Шакарима города Семей

Работа в формате PDF

508 KB

Автор работы награжден дипломом победителя II степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

Актуальность исследования. Эффективность и результативность любой науки зависят от степени познания, уровня анализа и диагностики основного предмета исследования. В современной фармакотерапии таковыми являются лекарственные средства растительного происхождения. Одним из важнейших классов действующих соединений, содержащихся в лекарственном растительном сырье, являются флавоноиды.

Интерес к флавоноидам велик ввиду присущего им широкого спектра биологического действия и антиоксидантной активности. Флавоноиды представляют собой многочисленной класс природных соединений, многообразие которых обуславливается, главным образом, строением агликона (степенью окисленности трехуглеродного фрагмента, положением бокового фенильного радикала, величиной гетероцикла и других признаках), а также составом гликозидного фрагмента.

Степень изученности данного вопроса: В современной науке огромное внимание уделяется поиску оптимальных путей использования флавоноидов в интересах укрепления здоровья людей, профилактики и лечения различных патологий, вызванных или сопровождающихся усилением свободно радикальных процессов окисления. В научной литературе имеется значительное количество публикаций, касающихся применения этих растений при лечении различных заболеваний и химическом составе. Однако в литературе практически отсутствуют данные о процентном содержании кверцетина в данных культурах.

Итак, в качестве пути решения данной проблемы можно предложить использование спектрофотометрического метода анализа, так как он является одним из наиболее доступных и объективных методов контроля биологически активных соединений в растительном сырье и суммарных фитохимических препаратах.

Объект исследования: плодово-ягодные культуры - виноград, вишня, малина, рябина.

Предмет исследования: анализ количественного содержания флавоноидов (кверцетина) в плодово-ягодных культурах (виноград, вишня, малина, рябина) методом спектрофотометрии.

Цель научной работы. Количественное определение флавоноидов (кверцетина) в плодово-ягодных культурах (виноград, вишня, малина, рябина) спектрофотометрическим методом.

Задачи:

1) изучить современные методы выделения и идентификации флавоноидов и выявить особенности (строение, физические и химические свойства) природных флавоноидов как объектов исследования;

2) изучить теоретические вопросы анализа флавоноидов в плодово-ягодных культурах спектрофотометрическим методом;

3) определить оптимальные условия экстрагирования кверцетина из выбранного растительного сырья;

4) провести количественное определение флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом.

Характеристика личного вклада автора работы в решение избранной проблемы: автор провела литературный обзор по предмету исследования, выполнила экспериментальную часть проекта под наблюдением руководителя, самостоятельно выполняла химические расчеты, обработку результатов и тщательно изучила пути решения проблем. Ученица показала себя как инициативный, творчески мыслящий исследователь с научным интеллектом и эрудицией в области знаний по химии, биологии. Она успешно решала поставленные перед ней задачи экспериментальной части работы, а именно, получила достоверные данные по анализу объектов исследования.

1 Теоретическая часть

1.1 Флавоноиды, виды, строение и биологическая активность

Многочисленные исследования флавоноидов позволили дать их довольно исчерпывающую классификацию и строение. Первоначально считали, что флавоноиды входят в состав лишь высших растений. Однако к настоящему времени они найдены у водорослей, хвощей, плаунов, папоротников, мхов, лишайников и грибов, что говорит о важной физиологической роли этих веществ у растений. Особенно богаты флавоноидами растения, относящиеся к семействам розоцветные, бобовые, гречишные, яснотковые, лютиковые, зонтичные, астровые, толстянковые, вересковые, рутовые, буковые, камнеломковые, лилейные и др. Содержание флавоноидов в растениях в среднем 0,5 — 5 %, а иногда 30 % (в цветках софоры японской). Они обнаружены в различных органах растений: в листьях, цветках, коре, камбии, древесине, плодах, оболочках плодов. Но в значительных количествах эти соединения накапливаются в надземных органах (цветки, плоды, листья), реже и в меньших количествах — в подземных частях растения (солодка, шлемник байкальский, стальник полевой) [1].

Флавоноидами называется группа природных биологически активных веществ (БАВ) – производных бензо-γ-пирона (рисунок 1.1), в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С₆-С₃-С₆ углеродных единиц. Это гетероциклические соединения с атомом кислорода в кольце [2].

Рисунок 1.1 – Структура бензо-γ-пирона

При замещении в хромоне атома водорода в α-положении на фенильную группу образуется 2-фенил-(α)-бензо-γ-пирон или флавон (рисунок 1.2), который состоит из 2 ароматических остатков А и В и трехуглеродного звена (пропановый скелет)

Рисунок 1.2 – Структура флавона

В зависимости от степени окисления и гидроксилирования пропанового скелета С₆-С₃-С₆ и положения фенильного радикала флавоноиды делятся на несколько групп (схема 1.1) [3].

Схема 1.1 – Классификация флавоноидов

Примерами флавоноидов, значимых для человека являются рутин и кверцетин [4]. Рутин – органическое соединение из группы флавоноидов, обладающее витаминной активностью. По химической структуре рутин представляет собой 5,7,3’,4’-OH-3-рамноглюкозид (рисунок 1.3) [5,6].

Рисунок 1.3 – Химическая структура рутина

Основные функции рутина: антиоксидантные, противовоспалительные, антиканцерогенные, антитромбические, противоязвенные, антиаллергические, противоотечные, спазмолитические, сахароснижающие, желчегонное действие; коррекция микроциркуляции крови и лимфы; укрепление стенок капилляров, защита от кровоизлияний; уменьшение венозного отека; сдерживание агрегации тромбоцитов; защита от токсинов; увеличение плотности костной ткани; ингибирование альдолазы, трансминазы, С – реактивного белка; ингибирование перекисного окисления липидов; увеличение активности адреналина; снижение активности щитовидной железы.

В организме человека рутин не вырабатывается. К основным природным источникам рутина относятся: листья гречихи, листья чайного куста, черная смородина, шиповник, клюква, соки черники и рябины, можжевельник (ягоды), боярышник (бутоны), ромашка (цветы), календула [3,6].

Кверцетин (рисунок 1.4) является агликоном рутина. По химической структуре кверцетин представляет собой 3,5,7,3'4'-Пентаоксифлавон [5,6].

Рисунок 1.4 – Химическая структура кверцетина

К основным функциям кверцетина относится: антиоксидантное, противоотечное, спазмолитическое, антигистаминное, противовоспалительное, диуретическое, противоязвенное, гипотензивное, иммуностимулирующее, противодиабетическое, гипогликемическое, противовирусное, ранозаживляющее, геропротекторное, анаболическое действия; снижение проницаемости стенок капилляров; повышение тонуса сосудов; блокада синтеза лейкотриенов и других воспалительных медиаторов; процессы ремоделирования костной ткани; эстрогено-подобное действие; нормализация выработки кортизона и инсулина; защита ЛНП-холестерина от окисления; улучшение реологии крови; угнетение синтеза тромбоксана; поддержка миокарда; стабилизация клеточных мембран; стимуляция ферментных систем; улучшение функций фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов; транспорт калия и натрия; адаптация к гипоксии; апоптоз раковых клеток.

В организме человека кверцетин, как и рутин, не вырабатывается. К основным источникам кверцетина природного происхождения относятся: брусника, черная смородина, малина, ежевика, клюква, черника, рябина, облепиха [3,6].

1.2 Методы определения флавоноидов

Так как, наряду с кверцетином, в растительных объектах находятся и относительно большие количества индивидуальных флавоноидов, то задача селективного их выделение из сырья и последующее их определение требует применения различных методов анализа природных объектов, которые дают возможность полностью охарактеризовать сложный состав и малое содержание флавоноидов.

В настоящее время для идентификации и количественного определения флавоноидов в лекарственных средствах широко используются физико-химические методы анализа, такие как спектрофотометрия, абсорбционная спектроскопия. Однако все большее распространение получают комбинированные методы, включающие различные варианты хроматографического разделения исследуемых компонентов. Широкое использование физико-химических и комбинированных методов анализа, в первую очередь, связано с тем, что эти методы обладают значительно большей чувствительностью и селективностью по сравнению с современными химическими и электрохимическими методами.

Для разделения флавоноидов между собой и отделения от cопутствующих веществ используется адсорбционно-хроматографический метод [7].

Для определения флавоноидов в вытяжках из растений, а также в пищевых продуктах чаще используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Метод ВЭЖХ является быстрым, хорошо воспроизводимым методом, который требует малого количества анализируемого вещества и используется для количественного, качественного анализа и препаративного выделения [8]. В данном случае селективное или групповое определение флавоноидов осложняется ограничением количества сорбентов.

Для количественного опреления флавоноидов используются объемные методы анализа. Так метод комплексонометрического титрования избытка ацетата свинца, не вступившего в реакцию осаждения с флавонолами, обладает достаточной избирательностью по отношению к флавоноидам и позволяет проводить определение флавонолов в присутствии ацетилсалициловой кислоты, антрахинонов, кумаринов. Однако метод длителен и не обладает избирательностью.

В современной науке для обнаружения и количественного определения флавоноидов в растительном сырье также используется метод капиллярного электрофореза [9]. Преимуществами капиллярного электрофореза являются: высокая эффективность разделения, экономичность (малый расход реактивов) и экспрессивность.

Количественное определение исследуемых флавоноидных соединении в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов. Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой спектрофотомерии или дифференциальной спектрофотометрии является одним из наиболее распространенных методов анализа флавоноидов. При этом рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые максимумы для флавоноидов – 330-370 нм, так и коротковолновые. Коротковолновые максимумы, хотя и более интенсивны, но в ряде случаев менее пригодны для аналитических целей из-за малой «площади» вершины пика, что приводит к большим ошибкам определения. Относительная ошибка прямого спектрофотометрического определения составляет ± 2-5 % и может быть снижена при дифференциальной методике анализа до 0.5-1.0 %. Рабочий интервал концентраций спиртовых, спирто-водных растворов составляет от 5 до 20 мкг вещества в 1 мл раствора [10].

Большей специфичностью обладают, хотя и не лишены недостатков, методики определения флавонолов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), азотнокислым галлием. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385-460 нм с хлористым алюминием, 385-500 нм с хлористым цирконилом, 400-455 нм с азотнокислым галлием. Наибольшей чувствительностью обладает методика с применением азотнокислого галлия, позволяющая количественно определять 0.5 мкг в 1 мл раствора, затем с хлорокисью циркония – 0.9-1.0 мкг и с хлористым алюминием – 1-2 мкг [11].

Широко распространена при определении общего количества флавоноидных соединений в растениях методика фотометрического определения по реакции комплексообразования с борной кислотой при длине волны 470 нм. Методика обладает теми же недостатками, что и методикакомплексообразования с солями металлов, и дает завышенные результаты, но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать их для ориентировочных определений. Относительная ошибка определения ± 3.35 %.

Одним из методов определения флавоноидных соединений по оптической плотности является также анализ продуктов взаимодействия с 4-аминоантипириновым реактивом. Однако данный анализ требует соблюдения ряда условий, как и при реакции диазотирования, и не является избирательным.

В ряду спектрофотометрических методов анализа флаванонов наиболее чувствителен боргидридный метод (до 0.5-1 мкг/мл при длинах воли 535-560 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизводимости результатов.

Таким образом, в современной науке огромное внимание уделяется поиску оптимальных путей использования флавоноидов в интересах укрепления здоровья людей, профилактики и лечения различных патологий, вызванных или сопровождающихся усилением свободнорадикальных процессов окисления. На основе флавоноидов возможно создание новых высокоактивных лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительной, антиканцерогенной, противовирусной, антипаразитарной или бактерицидной активностью. Исследования последних лет показали, что производные некоторых флавоноидов могут успешно использоваться при лечении различных заболеваний внутренних органов: эти вещества зачастую проявляют бóльшую эффективность, чем известные лекарственные препараты [12-22].

Важной особенностью флавоноидов и их производных является тот факт, что они обладают меньшей токсичностью и проявляют меньше побочных эффектов, чем аналогичные лекарственные средства, полученные из других источников. В настоящее время для идентификации и количественного определения флавоноидов в лекарственных средствах широко используются физико-химические методы анализа, такие как спектрофотомерия, абсорбционная спектроскопия. Широкое распространение физико-химических и комбинированных методов анализа, в первую очередь, связано с тем, что эти методы обладают значительно большей чувствительностью и селективностью по сравнению с современными химическими и электрохимическими методами.

Однако даже современная медицина пока еще не расшифровала в точности механизм старения клеток и их злокачественного предупреждения. Следовательно, до настоящего времени нет четкого понимания роли свободных радикалов в данных процессах. Как флавоноиды могут влиять на преждевременное старение, развитие онкологических болезней и накопление вредных мутаций в клетках, пока является загадкой.

2 Экспериментальная часть

2.1 Используемые реактивы, приборы и методики

Использованные реактивы:

1) 50% и 70% этиловый спирт, 2) 33% уксусная кислота, 3) Стандартный раствор кверцитина-0,05 мг/мл, 4) н-бутанол, 5) Дистиллированная вода, 6) 2% раствор алюминия хлорида

Оборудование:

1) Спектрофотометр ПЭ-5400ВИ с кварцевыми кюветами с толщиной слоя 10 мм, 2) Аналитические весы (AS220X)

Химическая посуда:

1) Круглодонная колба на 100мл, 2) Воронка, 3) Пипетка, 4) Цилиндр,

5) Пробирки, 6) Колба 50 и 100 мл, 7) Обратный холодильник,

8) Водяная баня (БВ-4)

2.2 Анализируемые объекты

Растительный материал. В работе были проанализированы литературные данные, на основании которых было выбрано сырье, содержащее наибольшее количество исследуемых флавоноидов: виноград, вишня, малина, рябина.

2.3 Методика получения экстракта

В круглодонную колбу с притертой пробкой вместимостью 50 мл помещают 5 г (точная навеска) измельченных плодов (частицы, проходящие сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм), прибавляют 30 мл 50% этилового спирта, присоединяют к обратному холодильнику и нагрева ют на кипящей водяной бане в течение 45 мин. Затем экстракт фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой в мерную колбу вместимостью 50 мл. Операцию выделения флавоноидов повторяют с 20 мл 50% этилового спирта в течение 45 мин. Полученную выжимку фильтруют в ту же колбу и доводят ее объем до метки 50% этанолом.

2.4 Определение флавоноидов спектрофотометрическим методом

В мерную колбу (25 мл) помещают 5 мл профильтрованного водно-спиртового экстракта, добавляют 5 мл 2% раствора алюминия хлорида, 0,5 мл 33% раствора уксусной кислоты и доводят объем колбы 90% этанолом до метки. Через 30 мин измеряют оптическую плотность испытуемого раствора и раствора стандартного образца кверцетина при длине волны 370 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор из 5 мл исследуемого экстракта, который помещают в мерную колбу (25 мл), добавляют 0,5мл 33% раствора уксусной кислоты и доводят объем колбы 90% этанолом до метки. Одновременно измеряют оптическую плотность кверцетина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

2.5 Результаты и их обсуждение

По массе анализируемого растения, объему полученного из него спиртового экстракта, показателя оптической плотности рассчитали концентрацию, массу кверцетина и его процентное содержание в анализируемых объектах (см. таблицу 1):

Таблица 1. Расчетные данные анализированных объектов исследования

Расчеты по спектрофотометрии:

1. Для малины:

С_х==0,1568 мг/мл

m_кв= С_х*V_{экстракта}=0,1568 мг/мл*50 мл=7,837 мг

х==0,14%

2. Для рябины:

С_х==0,1878 мг/мл

m_кв= С_х*V_{экстракта}=0,1878 мг/мл*50 мл=9,3919 мг

х==0,18%

3. Для винограда:

С_х==0,2486 мг/мл

m_кв= С_х*V_{экстракта}=0,2486 мг/мл*50 мл=12,43 мг

х==0,25%

4. Для вишни:

С_х==0,2054 мг/мл

m_кв= С_х*V_{экстракта}=0,2054 мг/мл*50 мл=10,27 мг

х==0,20%

Заключение

1) Флавоноиды - широко распространенные природные соединения, исключительно многогранны. В равной мере они интересны, как объекты изучения в ботанике, фармакогнозии, фитохимии и особенно в фармации и медицине.

2) Наиболее доступным и объективным методом контроля биологически активных соединений в растительном сырье и суммарных фитохимических препаратах физико-химические методы анализа, такие как спектрофотомерия, абсорбционная спектроскопия, хромато-масс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография. Широкое распространение физико-химических и комбинированных методов анализа, в первую очередь, связано с тем, что эти методы обладают значительно большей чувствительностью и селективностью по сравнению с современными химическими и электрохимическими методами и позволяет идентифицировать отдельные флавоноиды не зависимо от присутствия посторонних или родственных соединений.

3) Проведено определение содержание флавоноидов спектрофотометрическим методом в плодово-ягодных культурах. Процентное содержание флавоноидов в пересчете на кверцетин составило – вишня 0,20%; виноград 0,25%; рябина 0,18%; малина 0,14%. По результатам выяснилось, что самое большее количество кверцетина содержится в винограде.

4) На основе анализированных плодово-ягодных культурах возможно создание новых высокоактивных лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительной, антиканцерогенной, противовирусной, антипаразитарной или бактерицидной активностью. Эти вещества могут проявить бóльшую эффективность, чем известные лекарственные препараты.

Список использованных источников и литературы

1. Кузнецова О. Ю. 4. Кузнецова М. А. Лекарственное растительное сырье и препараты. - М.: Высшая, 1987. – 207с.

2. Яковлева Г.П. Лекарственное сырье животного и растительного происхождения. Фармакогнозия./ Г.П. Яковлева – Спб.: Спецлит, 2006. – 845с.

3. Биологически активные вещества растительного происхождения / Б.Н. Головкин, Р.Н. Руденская, И.А. Трофимова, А.И. Шретер. – М.: Наука, 2002.

4. Химия растительного сырья №4. – 2007. – С.73-77.

5. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия: учебник для высш. шк. / В.Г.Беликов – М.: МЕДпресс-информ, 2007. – 624 с.

6. Муравьева Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. – М.: Медицина, 2002. –656 с.

7. Корулькин, Д.Ю. Природные флаваноиды /Д.Ю. Корулькин, Ж.А. Абилов, Г.А. Толстиков. – Новосибирск: Наука, 2007. – 296с.

8. Сычев С.Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии «Милихром»: Монография/ С.Н. Сычев, К.С. Сычев, В.А. Гаврилина. – Орел: ОрелГТУ, 2002. – 134с.

9. Абдуллабекова В.Н. Идентификация рутина в растительном сырье методом капиллярного электрофореза/ В.Н. Абдуллабекова// Вестник фармации. – 2009. – №3. – С.23-28.

10. Каухова И. Е. Особенности экстрагирования биологически активных веществ двухфазной системой экстрагентов при комплексной переработке лекарственного растительного сырья / И. Е. Каухова // Растительные ресурсы. – 2006. – Т. 42. – Вып. 1. – С. 82-91.

11. Георгиевский В. П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В. П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук. – Новосибирск: Наука, 1990. – 144с.

12.Дегтярев Е. В. Применение тонкослойной хроматографии в анализе БАВ / Е. В. Дег.тярев, Б. В. Тяглов, В. Д. Красиков, А. В. Гаевский // 100 лет хроматографии. – М.: Наука, 2003. – 124с.

13. Органическая химия: учебник для вузов: В 2 кн. Кн.2: Специальный курс/ Н.А. Тюкавкина, С.Э. Зурабян, В.Л. Белобородов и др.; под ред. Н.А. Тюкавкиной. – М.: Дрофа, 2008. – 592с.

14. Васильев В. П. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа: учеб. для студ. вузов, обучающихся по химико-технол. спец. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Дрофа, 2002. – 384 с.

15. Лебедева М.И. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа: учеб. пособие/ М.И. Лебедева. – Тамбов: ТГТУ, 2005. – 216с.

16. Абдуллабекова В.Н. Идентификация рутина в растительном сырье методом капиллярного электрофореза/ В.Н. Абдуллабекова// Вестник фармации. – 2009. – №3. – С.23-28.

17. Бекетов Е. В. Идентификация и количественная оценка флавоноидов в плодах черемухи обыкновенной/ А. А. Абрамов, О. В. Нестерова // Вестник Московского университета. Химия. –2005. – Т. 46 – № 4 –С. 259–262.

18. Бубенчиков Р. А. Флавоноиды фиалки трехцветной/ И. Л. Дроздова// Фармацевтическая химия и фармакогнозия. – 2004. –№ 2. – С. 11–12.

19. Garcia A., Bocanegra-Garcia V., Palma-Nicolas J. P., Rivera G. Recent advances in antitubercular natural products. // Eur.J.Med.Chem. – 2012. – V. 49– P. 1–23.

20. Saleem M., Nazir M., Ali M. S., Hussain H., Lee Y. S., Riaz N., Jabbar A. Antimicrobial natural products: an update on future antibiotic drug candidates. // Nat.Prod.Rep. – 2010. – V.27 – Р.238–254.

21. Hemaiswarya S., Kruthiventi A. K., Doble M. Synergism between natural products and antibiotics against infectious diseases. // Phytomedicine. – 2008. –V.15 – Р.639–652.

Приложение 1. Выполнения практической части

научно-исследовательской работы

Фото 1. Подготовка прибора - спектрофотометр ПЭ-5400ВИ для проведения анализа

Фото 2. Определение оптической плотности анализируемых объектов на спектрофотометре ПЭ-5400ВИ

Приложение