VII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
Анализ выделяемых пигментов растениями, выращенными в различных условиях, методом тонкослойной хроматографии
Автор работы награжден дипломом победителя II степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Введение
Анализ микрообразцов многокомпонентных смесей веществ является традиционной задачей аналитической химии. Одними из наиболее удобных методов разделения таких смесей являются хроматографические, в частности тонкослойная хроматография (ТСХ). ТСХ благодаря простоте и скорости выполнения широко применяется в предварительных экспериментах, но требует навыков и тщательности в исполнении. Этот метод незаменим при анализе большого количества образцов (например, для оценки чистоты медицинских препаратов), применяется также для идентификации веществ и установления подлинности с помощью «свидетеля». [4]
Методика ТСХ по сути является трехфазным процессом: сорбент, элюент, окружающая среда. Поэтому необходимо учитывать и минимизировать влияние внешних факторов (температуры, влажности). Традиционной проблемой является оптимизация состава подвижной фазы и правильный выбор сорбента (неподвижной фазы).
В качестве объекта исследования было выбрано растение кресс-салат.
Целью нашей работы стало сравнение состава растительных пигментов растения, экземпляры которого произрастали в разных условиях.
Для достижения данной цели были поставлены задачи:
выращивание экземпляров растения в комфортных и ненадлежащих условиях (низкой освещенности, чрезмерного тепла);
сравнение физико-химических свойств традиционных растворителей, применяемых в ТСХ;
сравнение физико-химических свойств сорбентов;
отработки методики ТСХ на модельной смеси липофильных красителей.
экспериментальное подтверждение пригодности различных подвижной и неподвижной фаз для выбранного объекта анализа;
Литобзор
Что представляет собой метод тонкослойной хроматографии?
Тонкослойная хроматография – способ разделении смеси веществ, основанный на различном сродстве этих веществ к неподвижной фазе (сорбенту) и подвижной фазе (элюенту). Компоненты, имеющие высокое сродство к сорбенту, остаются на старте хроматограммы или медленно продвигаются с фронтом растворителя. Количественно это свойство отражает показатель Rf. Элюент движется под действием капиллярных сил.
Историческая справка
Хроматография была изобретена Михаилом Семёновичем Цветом. В 1903 г. на съезде естествоиспытателей и врачей он сделал доклад «Методы и задачи физиологического исследования хлорофилла», в котором впервые рассказал о методе адсорбционной хроматографии. Цвет долгое время решал задачу разделения пигментов зеленого листа, очень близких по своим свойствам. Так, каротиноиды (благодаря которым осенью у листьев появляется яркая окраска) невозможно отделить, пока не разрушатся хлорофиллы.
Метод, который применил М. С. Цвет, называется колоночной хроматографией. Другим вариантом хроматографии является плоскостная (бумажная и тонкослойная).
Современная плоскостная хроматография была разработана в 1938 г. Н. А. Измайловым и позже была доработана М. С. Шрайбером. С тех пор этот метод активно используется во всем мире. [7]
Основные сорбенты
Силикагель − наиболее распространённый сорбент. Его получают полимеризацией кремниевой кислоты, получаемой гидролизом или воздействием соляной кислоты на силикат натрия. Силикагель является гидрофильным сорбентом, частично растворимым в воде при 20оС.
Рис 1. Структура силикагеля
Оксид алюминия - второй, часто используемый в ТСХ сорбент (обладает большей полярностью чем силикагель). Его получают дегидратацией гидроксида алюминия. При нагревании происходит удаление воды с образованием структуры Al‑O‑Al, имеющей в составе основные гидроксильные группы.
На слоях оксида алюминия возможно хорошее хроматографическое разделение кислот, спиртов, фенолов или аминосоединений. Более размытые зоны следует ожидать для карбонильных соединений, эфиров, которые не способны образовывать водородные связи сорбентом.
Рис. 2. Классификация сорбентов по их свойствам [4]
Выбор элюента
В качестве элюентов для тонкослойной хроматографии часто используются органические растворители. Применяя элюенты, очень важно следить за их чистотой. В основном используют, только двухкомпонентные смеси, так как при использовании более двух растворителей результаты трудновоспроизводимы. Взаимную растворимость растворителей иллюстрирует схема на рис. 3.
Рис. 3. Взаимная смешиваемость растворителей [6]
Виды тонкослойной хроматографии
По способу продвижения элюента различают типы ТСХ: восходящая, нисходящая горизонтальная (рисунки 4, 5,6).
Рис 4. Восходящая хроматография [4]
Рис. 5,6. Нисходящая (вертикальная) и горизонтальная хроматография [4]
1.6. Фактор удерживания Rf
В соответствии с коэффициентами распределения разделяемые компоненты переносятся подвижной фазой вдоль слоя сорбента, образуя отдельные зоны. Положение каждой зоны характеризуется величиной Rf (rate fraction – дословно «фракционная норма») – физический смысл которой определяется отношением скоростей движения зоны определяемого вещества и элюента. На практике измерить эту величину довольно трудно. Величину Rf, называемую подвижностью, экспериментально определяют как отношение расстояния l, пройденного веществом от точки нанесения пробы до центра зоны, к расстоянию L, пройденному элюентом от линии старта до линии фронта элюента за то же время.
Величина Rf является индивидуальной характеристикой соединения, хроматографируемого в данном растворителе в условиях опыта, и изменяется от 0 до 1. Оптимальным для практической ТСХ является интервал изменения Rf от 0,2 до 0,8. При Rf = 0 вещество не движется, при Rf = 1 вещество не задерживается неподвижной фазой и движется с фронтом растворителя.
Рис. 7. Расчет Rf[4]
1.7 Ультрафиолетовый хроматографический облучатель
Ультрафиолетовый облучатель предназначен для определения веществ по их люминесценции под действием УФ облучения. Выпускаются УФ-кабинеты двух типов: УФС 254/365, УФО-254.
При облучении УФ с длиной волны 365 нм разделенные вещества на пластинах флюоресцируют яркими пятнами разного цвета. Чувствительность детектирования в таком свете увеличивается с ростом интенсивности облучения. При облучении УФ с длиной волны 254 нм изменяется окраска веществ и контрастность.
В зависимости от хроматографической системы выбирают подходящую длину волны облучения.
Ультрафиолетовый облучатель (в нашей работе это УФС 254/365) дает возможность увидеть наличие некоторых пигментов на сорбенте, которые не видно при дневном свете.
1.8 Спектры поглощения растительных пигментов
Пигменты – важнейшие компоненты фотосинтеза. Их относят к трем классам: хлорофиллы, фикобилины и каротиноиды.
Хлорофилл
Все фотосинтезирующие растения, включая все водоросли, а также цианобактерии, содержат хлорофиллы группы а (рис. 8). Хлорофилл b представлен у высших растений, зеленых водорослей и представителей эвгленовых.
Хлорофиллы хорошо растворяются в этиловом эфире, бензоле, хлороформе, ацетоне, этиловом спирте и не растворяются в воде.
Для наблюдения флуоресценции хлорофилла, его нужно экстрагировать в неполярный растворитель, а после облучить экстракт УФ лампой.
При замещении атома магния протонами в молекуле хлорофиллов образуется феофетин. Резко выраженные максимумы поглощения хлорофиллов лежат в красной и синей частях спектра. В диэтиловом эфире максимумы поглощения хлорофиллов группы а находятся в областях 660-663 нм и 428-430 нм, хлорофилла b в пределах 642-644 и 452-455 нм. Хлорофиллы слабо поглощают оранжевый и желтый свет и совсем не поглощают зеленые и инфракрасные лучи.
Рис. 8. Структурная формула хлорофилла a и b [2]
Каротиноиды
Каротиноиды присутствуют (рис. 9) в хлоропластах всех растений и являются жирорастворимыми веществами.
К каротиноидам относят три группы соединений: оранжевые или красные пигменты каротины, желтые ксантофиллы, каротиноидные кислоты - продукты окисления каротиноидов с укороченной цепочкой и карбоксильными группами. Каротины и ксантофиллы хорошо растворимы в хлороформе, бензоле, сероуглероде, ацетоне. Каротины легкорастворимы в предельных углеродах и диэтиловом эфирах, и почти нерастворимы в более полярных метаноле и этаноле.
Их основными функциями являются: участие в поглощении света в сине-фиолетовой и синей частях спектра (400-500 нм), защита молекул хлорофиллов от фотоокисления и участие в кислородном обмене при фотосинтезе.
Рис. 9. Структурная формула каротиноида [2]
Фикобилины
Это красные и синие пигменты, содержащиеся в хроматофорах некоторых водорослей (рис. 10). К фикобилинам относятся фикоцианин и фикоэритрин (окисленный фикоцианин). Фикобилины поглощают свет в зеленой и желтой части видимого спектра (фикоэритрин 495-565 нм, фикоцианин 550-615 нм).
Рис. 10. Структурная формула фикобилина [2]
2. Экспериментальная часть
2.1 Методика анализа методом ТСХ
Подготавливают пластины необходимого размера (ширина 1,0-2,0 см, длина 10‑15 см). Иглой отмечают линию старта на расстоянии 1,0-1,5см от начала пластинки и линию финиша на расстоянии 0,5‑1,5 см от конца пластинки.
На линию старта по центру пластины наносят исследуемую смесь объемом 5‑20 мкл микропипеткой. Пластинку высушивают.
В хроматографическую камеру помещают элюент (толщина слоя жидкости 0,5‑1,0 см) и фильтровальную бумагу, пропитанную элюентом. Закрывают камеру и оставляют на некоторое время для насыщения парами растворителя.
Помещают пластинку в камеру. Растворитель начинает подниматься по пластине под действием капиллярных сил, увлекая за собой компоненты анализируемой смеси.
По достижении линии финиша фронтом растворителя пластину достают из камеры и высушивают. [3]
Пластину помещают в облучатель УФС 254/365 и оценивают фактор удерживания для компонентов растительных пигментов. [5]
Оптимизация состава смешанного растворителя
В предварительной серии экспериментов для разделения растительных пигментов использовали чистые растворители − неполярные, малополярные и неполярные. В таблице 1 приведены свойства растворителей при температуре 25 оС (диэлектрическая проницаемость ε, температура кипения и динамическая вязкость η). Для сравнения в таблицу включены свойства воды.
Таблица 1. Свойства некоторых растворителей для ТСХ [1]
|
Элюент |
Ε |
η, МПа∙с |
tкипоС |
|
Вода |
80 |
1,004 |
100 |
|
Бензол |
2,27 |
0,604 |
80,1 |
|
Толуол |
2,3 |
0,560 |
110,6 |
|
Ацетон |
20,9 |
0,306 |
56,1 |
|
Гексан |
1,89 |
0,300 |
68 |
|
Этанол |
26,8 |
1,074 |
78,4 |
Таблица 2. Предварительное хроматографическое разделение хлорофилла а
|
№ опыта |
Элюент |
Rf |
|
1 |
Бензол |
0,00 |
|
2 |
Толуол |
0,07 |
|
3 |
Ацетон |
0,99 |
|
4 |
Гексан |
0,00 |
|
5 |
Этанол |
0,68 |
Таблица 3.
Хроматограммы с чистыми растворителями в качестве элюента
|
Элюент |
Хроматограмма |
|
Бензол |
|
|
Толуол |
|
|
Гексан |
|
|
Ацетон |
|
|
Этанол |
Предварительный эксперимент показал, что в полярных растворителях, все компоненты экстракта остаются на старте, разделения не происходят. В неполярных растворителях компоненты хлорофилла уходят с фронтом растворителя, разделения также не происходит, в слабо полярных растворителях хлорофилл остаются вблизи линии старта, поэтому можно сделать вывод о необходимости применения смешанного растворителя, а именно полярного и неполярного растворителя.
В таблице представлены результаты ТСХ при варьировании состава смеси смешанного растворителя (толуол, ацетон). Компоненты растворителя сильно отличаются по полярности (ɛ толуола 2,0-2,4; ɛ ацетона 20,6)
Таблица 4.
Зависимость разделения от состава элюента, экстрагент - ацетон, неподвижная фаза Silufol
|
Элюента |
Хроматограмма |
|
Толуол: Ацетон 5: 2 |
|
|
Толуол: Ацетон 4: 1 |
|
|
Толуол: Ацетон 10: 3 |
|
|
Толуол: Ацетон 5: 1 |
|
|
Толуол: Ацетон 1: 1 |
|
|
Толуол: Ацетон 7: 3 |
Экспериментально показано, что лучшее разделение происходит при объемном соотношении толуол и ацетон 7:3. В данной системе удалось обнаружить 8 пигментов, и 4 из них идентифицировать.
Анализ пигментов растений, выращенных в разных условиях.
При дефиците освещенности и повышенной температуре, листья растений пожелтели и их хроматограммы представлены в таблице 4.
Приведенные в таблице хроматограммы свидетельствуют, что пигментный состав растения, выращенного в неблагоприятных условиях, обеднен и даже при УФ облучении пигменты не были обнаружены.
Таблица 5.
Хроматограммы пигментов кресс-салата
|
Условия |
Хроматограмма |
|
Неблагоприятные |
|
|
Благоприятные |
Выводы
Приобретя навыки анализа методом ТСХ и ознакомившись с физико-химическими свойствами наиболее часто применяемых элюентов и сорбентов, мы смогли подобрать оптимальный состав смешанного растворителя (Толуол : Ацетон, 7 : 3) и с его помощью разделили 8 пигментов зеленого листа и идентифицировали некоторые из их.
Показали и смогли убедится, что пигментный состав растений, выращенных в разных условиях также различен.
В дальнейшем мы планируем провести серию экспериментов с разными сорбентами при варьировании состава подвижной фазы.
Список литературы
Основы диэлектрической спектроскопии. Учебное пособие. Гусев Ю.А. Физический факультет Казанского государственного университета.
Балашовский филиал Саратовского государственного университета им Н.Г. Чернышевского. М.А.Занина. ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ. Учебно-методическое пособие для студентов заочного отделения факультета экологии и биологии. 2005 г.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К КУРСУ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ для студентов первого курса факультета фундаментальной медицины МГУ http://www.chem.msu.su/rus/teaching/analyt/medcine/partIII.pdf
ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» Е.Г. Сумина, С.Н. Штыков, В.З. Угланова, Н.В. Кулакова «Тонкослойная хроматография. Теоретические основы и практическое применение Учебное пособие.» Саратов, 2012 г.
Бёккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: методы хроматографии и капиллярного электрофореза, 2009.
Химическая энциклопедия в 5 томах. / под ред. Кнуняца И. Л. Издательство: М.: Советская Энциклопедия, Большая Российская энциклопедия. 1988 - 1999 г.
«Герои, злодеи, конформисты отечественной науки». Шноль Симон.