VIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся

Старт в науке

Фитохимический анализ и изучение перспектив использования в медицине листьев пеларгонии

• Авторы
• Руководители
• Файлы работы
• Наградные документы

Махно И.П. 1

---

1Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение школа №1539

Нестерова О.В. 1

---

1Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет) Министерства здравоохранения Российской Федерации

Работа в формате PDF

720.3 KB

Автор работы награжден дипломом победителя I степени

Диплом школьникаСвидетельство руководителя

Введение

На сегодняшний день одними из наиболее распространенных заболеваний являются бактериальные инфекции, которые по медико санитарной значимости, влиянию на общее состояние здоровья и качества жизни пациентов занимают одно из первых мест по данным экспертов Всемирной Организации Здравоохранения.
В отоларингологии воспалительные заболевания наружного слухового прохода обусловленные бактериальной инфекцией являются наиболее широко распространенными, частота наружных диффузных отитов
в отоларингологической практике составляет до 25 процентов от всех зафиксированных патологий лор-органов. По данным отечественных ученых
у 10 процентов населения был зарегистрирован хотя бы единственный эпизод острого наружного отита. В стандарте лечения наружного отита предусмотрено использование антибиотиков или антибактериальных препаратов, однако не смотря на многообразие предложенных антибактериальных лекарственных средств на ряду с положительными результатами лечения наружного отита, отмечаются и не однократные рецидивы, составляющие около 20 процентов, (12) что может быть связано с формированием резистентной микрофлоры и как следствие неэффективностью антибактериальной терапии. Учитывая выше изложенное, внимание ученых при выборе терапевтической схемы лечения наружного отита, микробный спектр возбудителя представлен преимущественно Pseudomonas aeruginoza, Staphylococcus aureus (7), как в монокультуре, так
и в составе микробных ассоциаций все чаще привлекают лекарственные растения, обладающие антимикробным действием.

Как известно народная медицина для лечения отита широко использует листья пеларгонии - широко культивируемого в РФ растения. Пеларгония относиться к семейству гераниевых, которое насчитывает 11 родов и около 800 видов. Среди гераниевых встречаются полукустарники, но основная масса состоит из многолетних и однолетних трав. Листья рассеченные или пальчато-рассеченные, края листа зубчатые или же ровные. Основная масса семейства гераниевых произрастает в Южной Америке, но встречаются растения по всему миру в виде комнатных растений и в качестве грунтовых культур.

Анализ научной литературы показывает наличие значительного количества статей, посвященных изучению химического состава и антибактериальной активности листьев пеларгонии. Внимание исследователей привлекли фракции эфирного масла пеларгонии и фенольные соединения экстрагируемые этиловым спиртом. Из основных фенольных производных, преимущественно относящихся к классу флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и дубильных веществ в водно спиртовых извлечениях из пеларгонии выделяются следующие группы представленные на схеме(1),

Схема(1) Содержание основных групп БАВ в листьях пеларгонии по литературным данным.

К основным фармакологическим свойствам гераниевых относят обезболивающее, вяжущее, антисептическое, кровоостанавливающее
и противовоспалительное действия, при чем антибактериальное и антигрибковое действие выражено особенно сильно. По данным группы авторов(8) использование масла пеларгонии для профилактики респираторных инфекций приводит к снижению числа случаев ОРЗ на 65 процентов, а использование у часто болеющих детей при первых признаках заболевания позволяет облегчить лечение и предотвратить развитие осложнений. Эфирное масло герани обладает широкой антимикробной активностью, что доказано в испытании на пяти тест-культурах. Результаты определения антимикробной активности эфирного масла пеларгонии представляю в таблице 1:

Таблица 1 Антимикробная активность эфирного масла пеларгонии

Примечание: (-) - рост тест культуры отсутствует:

(+) - слабый рост тест культуры

(++) - рост соответствует 50 процентам контроля

(2)

В СССР активно проводились исследования, направленные на выявления специфической активности масла пеларгонии при воздействии на возбудителя гнойного отита (11), (5), (4).

По данным некоторых авторов, для масла пеларгонии характерно наличие выраженных антиоксидантных свойств, что позволяет предполагать у них наличие комплексного эффекта при лечении гнойного отита.

Однако в настоящее время листья пеларгонии в РФ не являются фармакопейным лекарственным растительным сырьем, что обусловлено не достаточной изученностью состава биологически активных веществ (далее-БАВ), отсутствием товароведческих показателей качества сырья и как следствие отсутствием современной нормативной документации.

Учитывая выше изложенное, исследования направленные на расширение информации о БАВ-ах пеларгонии, анализ товароведческих характеристик сырья, а также оценка перспективности использования сырья пеларгонии и препаратов на его основе являются актуальными и своевременными.

Цель нашей работы - проведение анализа сырья (листьев пеларгонии) с последующей оценкой перспективности использования их в медицине и фармации.

Для достижения поставленной цели нам необходимо решить следующие конкретные задачи:

1) Провести анализ научной литературы, патентной и нормативной документации характеризующей современное состояния проблемы использования в медицине листьев пеларгонии, а также уровня их стандартизации;

2) Провести анализ макро- и микроскопических признаков листьев пеларгонии для выявления значимых морфологических и анатомо диагностических признаков;

3) Провести предварительный фитохимический анализ сырья, направленный на выбор методик идентификации наиболее важных групп БАВ листьев пеларгонии;

4) Предложить методику количественного определения выбранной для стандартизации группы БАВ;

5) На основании полученных данных обосновать необходимые показатели качества и методов стандартизации сырья (листьев пеларгонии);

В представленной на сегодняшний день научной литературе данные о фармакологический активности и содержании БАВ герани, носят констатационный характер и не способствуют созданию единой концепции аналитических мер направленной на разработку нормативной документации. Учитывая выше сказанное, исследования, включающие анализ морфологических и анатомо диагностических признаков, идентификацию различных групп БАВ, а также оценку количественного содержания основной, определяющей фармакологическую активность группы, полностью отвечают критериям научной новизны.

Полученные в ходе самостоятельного исследования результаты анализа морфологических и анатомо диагностических признаков могут быть использованы в разделах «Внешние признаки» и «Микроскопия», в разрабатываемой нормативной документации. Результаты идентификации групп БАВ и методики, использованные для идентификации, могут быть включены в разделы «Качественные реакции». Результаты определения эфирного масла в исследуемом сырье могут быть использованы для нормирования данного показателя. Все выше изложенное подтверждает практическую значимость проведенной работы.

Основная часть.

1. Материалы и методы исследования.

1.1. Объект исследования.

Объектом нашего исследования явились образцы пеларгонии, приобретенные в цветочных магазинах города Москвы и культивируемые в домашних условиях, так же дикорастущие образцы, собранные с культивируемых растений, используемых в декоративных клумбах при озеленении парковых зон города Ейска, Краснодарского края. Заготовку листьев осуществляли срезанием, после чего полученные образцы исследовались для определения макро- и микродиагностических признаков.В анализе использовалось как свежесобранное, так и высушенное сырье.

1.2. Методики анализа макро- и микродиагностичеких признаков

листьев пеларгонии.

Анализ макро- и микродиагностичеких признаков листьев пеларгонии осуществляли в соответствии с требованиями ОФС.1.5.1.0003.15 «Листья». Для определения внешних признаков свежие листья раскладывали на стеклянной пластинке тщательно расправляя, после чего рассматривали сначала невооруженным глазом, затем с помощью лупы 10x. Размер определили с помощью измерительной линейки. Нами проводились измерения длины, ширины пластинки листа пеларгонии, длины и диаметра черенка. Цвет анализируемого листа пеларгонии проверяли с двух сторон при дневном освещении. Запах при растирании кусочка листовой пластины. Вкус определяли, разжевывая образец высушенного сырья.

При определении микродиагностических признаков, нами готовились микропрепараты листа пеларгонии в соответствии с ОФС «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов». Для исследования использовали кусочки листьев пеларгонии, выбирая участки с края и основной жилкой, от основания и верхушки. Исследуемые образцы рассматривались с поверхности.

1.3. Методика проведение качественных реакций.

Учитывая рекомендации ОФС.1.5.1.0003.15 «Листья», качественные реакции проводили с водным извлечением из листьев по методикам, позволяющим идентифицировать в сырье эфирное масло, флавоноиды, дубильные вещества, гидроксикислоты и сапонины, поскольку наличие данных групп веществ характерно для исследуемого сырья согласно литературным данным.

1.4. Методы количественное определения.

Количественное определения содержания эфирного масла в пеларгонии проводили в соответствии с требованием ОФС.1.5.3.0010.15 «Определение содержания эфирного масла в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах». Определение содержания эфирного масла осуществляли методом его перегонки с водяным паром из предварительно измельченных свежих и высушенных листьев пеларгонии с последующим измерением отогнанного объема. Выход эфирного масла рассчитывали в массо-объемных процентах, для анализа использовали точную навеску исследуемого сырья, взвешенного на аналитических весах. Для определения эфирного масла нами использовался метод, применяемый к сырью, для которого характерна существенная массовая доля эфирного масла, а также отсутствие термолабильных компонентов.

2. Макро- и микродиагностический анализ листьев пеларгонии.

2.1 Макродиагностический анализ листьев пеларгонии.

При проведении анализов макродиагноститеских признаков выявлены незначительные отличия свежих и высушенных листьев пеларгонии. В ходе проведения анализов были установлены признаки, характеризующие внешний вид сырья представленные в таблице (2) анализ морфологических признаков листьев пеларгонии.

Таблица(2) Макродиагностические признаки листьев пеларгонии.

2.2 Микродиагностический анализ листьев пеларгонии.

При определении микродиагностических признаков листьев пеларгонии микропрепараты готовили в соответствии с общепринятыми методиками. Эпидермис листа представлен довольно крупными, сильно извилистыми клетками стенки которых имеют четко выраженные утолщения. Клетки эпидермиса над жилками имеют более вытянутую форму изодиаметрическую основанию жилки.
В эпидермисе верхней и нижней стороны листа встречаются многочисленные устьица, окруженные 4 и более клетками эпидермиса, (аномоцитный тип устьичного комплекса) весь эпидермис листа покрыт многочисленными многоклеточными, простыми и головчатыми (многоклеточная ножка и многоклеточная головка). На месте их отрыва обнаруживаются округлые места прикрепления волосков, в мезофилле листа встречаются крупные друзы оксалата кальция, а также мешки с кристаллическим песком. Мезофилл листа рыхлый, проводящая система листа пеларгонии образует развитую сеть жилок, анализ данных микроскопического исследования листьев пеларгонии свежих
и высушенных показал идентичность выявленных признаков среди которых, на наш взгляд, диагностическое значение имеют размер и форма клеток эпидермиса, расположение и строение простых многоклеточных и головчатых многоклеточных волосков, а также особенности места их прикрепления на эпидермисе, наличие друз оксалата кальция и клеток с кристаллическим песком.

Рис(1) Микроскопический анализ листа с поверхности

1- головчатый волосок

2-место прикрепления волоска

3- друза оксалата кальция

Рис(2) Микроскопический анализ листа с поверхности

1-аномоцитный устьичный комплекс

2-типичное строение эпидермальных клеток

3. Выделение эфирного масла и анализ выделенных веществ.

Учитывая имеющиеся данные литературы и рекомендации государственной фармакопеи, нами был проведен ряд качественных реакций, направленных на выявление эфирного масла, флавоноидов, дубильных веществ и сапонинов.

3.1. Определении эфирного масла.

Эфирные масла — сложные смеси летучих органических соединений (в основном терпеноидной природы), вырабатываемые растениями и обуславливающие их запах. По многочисленным литературным данным пеларгония накапливает значительное количество эфирного масла, в ходе нашего анализа, измельченные листья пеларгонии поместили в пробирку с газоотводной трубкой, добавили около 3 мл дистиллированной воды, конец газоотводной трубки опустили в другую пробирку, помещенную в стакан с колотым льдом (рис 3). Сырье в первой пробирке нагревали до кипения, в результате чего в пробирку, которая находилась в стакане с колотым льдом, было отогнано около 1 мл дистиллята, запах дистиллята напоминал запах листьев пеларгонии при растирании.

Для доказательства насыщенности терпеноидов характерных для эфирного масла пеларгонии к нему добавили 2 капли 2% калия перманганата, который м оментально обесцветился.

Рис.3 Рис.4

3.2. Анализ дубильных веществ.

Для идентификации дубильных веществ в листьях пеларгонии пользовались традиционными фармакопейными реакциями:

1 При добавлении к 3 мл извлечений 3-4 капель хлорида железа (III) появлялось фиолетовое окрашивание характерное для гидролизуемых дубильных веществ, которое затем переходило в черно-зеленое, характерное для конденсированных дубильных веществ, что говорит о присутствии двух типов дубильных веществ в сырье пеларгонии. Схему химической реакции происходящей с хлоридом железа и дубильными веществами рассмотрим на примере простого фенола, т.к. и вещества конденсируемые и гидролизуемые
в большом количестве содержат фенольные фрагменты (структура гидролизуемых дубильных веществ и схема реакции фенола с солями 3 валентного железа) (рис 5)

(рис 5)

2. К 3 мл извлечений листьев пеларгонии добавляли 1 процентный раствор желатина и наблюдали образование мути голубоватого цвета, которая растворялась при добавлении избытка реактива, что свидетельствовало о присутствии в сырье дубильных веществ.

3 . К 3 мл извлечений листьев пеларгонии добавили несколько кристаллов натрия гидрата и две-три капли 1 процентного раствора соляной кислоты, наблюдали образования кирпично-красного окрашивания, доказывающего наличие дубильных веществ (рис 6) в гидролизуемой группе.

4. К 3 мл извлечений листьев пеларгонии добавили несколько капель раствора нитрата свинца, в результате чего образовывался пышный серый осадок. (однако данная реакция не является специфической для нитрата свинца т. к. с нитратом свинца взаимодействуют флавоноиды и сапонины).

3.3. Анализ флавоноидов.

Для определения веществ флавоноидной природы, с извлечением из листьев пеларгонии проводили ряд качественных анализов.

1) К 2 мл извлечений, добавили 2 мл концентрированной соляной кислоты и одну гранулу цинка, наблюдали бурное выделение водорода с одновременным развитием интенсивной малиновой окраски, данная реакция носит название цианидиновой пробы и позволяет идентифицировать в сырье вещества флавоноидной природы, химизм реакции приводим ниже (рис 7)

( рис 7)

2 ) К 2 мл извлечений листьев пеларгонии добавляли несколько капель раствора натрия гидроксида, появилось желтое окрашивание характерное для перехода флавоноидов в халкон.

(рис 8)

3.4. Количественное определение содержания эфирного масла в исследуемом сырье.

Количественное определения содержания эфирного масла в пеларгонии проводили в соответствии с требованием ОФС.1.5.3.0010.15. Нами использовался метод применимый для растительного сырья накапливающего значительное количество эфирного масла, компоненты которого являются термостабильными.

Измельченное лекарственное растительное сырье, погружали в широкогорлую круглодонную колбу объемом 1 литр, наливали 300 г дистиллированной воды и запирали резиновой пробочкой (с обратным шариковым холодильником). К пробке снизу закрепляли крючочки, на них с помощью проволоки вешали градуированный приемник, заранее наполненный дистиллированной водой, при этом конец холодильника находился над расширением приемника, не трогая его. Приемник свободно помещался в горле колбы, не касаясь стенок, и находился от воды не менее чем на 50 мм. 0,025 мл-цена деления приемника.

Колбу нагревали на электрической плите до закипания и поддерживали в кипящем состоянии в течении 30 минут.

Объем эфирного масла измеряли после окончания перегонки и достижения эфирным маслом комнатной температуры. Содержание эфирного масла в исследуемых листьях пеларгонии составило в свежесобранном сырье 1,53%, в высушенном 1,28%. Таким образом, основываясь на данных научной литературы и результатах собственных экспериментальных исследований нами была проведена оценка перспективы использования листьев пеларгонии и препаратов на их основе в современной медицине и фармации, также считаем необходимым разработать документацию по обязательному высаживанию растений пеларгонии в учебных помещениях, что в соответствие с имеющими литературными данными позволит снизить заболеваемость ОРВИ.

Заключение

Нами был проведен анализ научной литературы и нормативной документации, характеризующей современное состояния проблемы использования в медицине листьев пеларгонии, а также уровня их стандартизации. Было установлено, что несмотря на значительное количество научных исследований подтверждающих противовоспалительное и антимикробное действие масла листьев пеларгонии отсутствует системный подход позволяющий осуществить стандартизацию исходного сырья и получаемого на его основе масла, стандартизация которых осуществляется на основании технических ГОСТов, что препятствует введению данного сырья в широкую медицинскую практику;

Был проведен анализ макро- и микроскопических признаков листьев пеларгонии для выявления значимых морфологических и анатомо диагностических признаков, в соответствии с требованиями ОФС.1.5.1.0003.15 «Листья» и ОФС.1.5.3.0003.15 «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного сырья и лекарственных растительных препаратов». Проведен предварительный фитохимический анализ сырья направленный на выбор методик идентификации наиболее важных групп БАВ листьев пеларгонии, среди которых для включения в нормативную документации могут быть рекомендованы методы выделения и определения не предельности эфирного масла пеларгонии, методы определения флавоноидов и дубильных веществ, поскольку данные методы идентификации демонстрируют хорошую воспроизводимость результатов как для свежесобранного, так и для высушенного сырья пеларгонии. Содержание эфирного масла в исследуемых листьях пеларгонии составило
в свежесобранном сырье 1,53%, в высушенном 1,28%.

Список использованных источников и литературы:

1) ГОСТ ISO 4731-2014 Масло эфирное гераниевое (Pelargonium x ssp.) Технические условия;

2) (Гребова Л. П., Бесараб Г. А., Лобанова Е. И. Профилактика и комплексная терапия ОРВИ. Эффективность ингаляционного воздействия натуральных эфирных масел CONSILIUM MEDICUM. Приложение болезни органов дыхания 2013, №1 1224);

3) (Кустов М.О. Комплексное лечение воспалительных заболеваний наружного слухового прохода. Автореф. дисс. к.м.н. Санкт-Петербург 2012, 23с.);

4) (Лайко А.А. Лечение больных рецидивирующим средним отитом//журнал ушных и горловых болезней 1998-номер5. -страница27-32);

5) (Макаренко Н. Г. Антимикробная активность эфирных масел некоторых лекарственных растений //Изв. СО АН СССР. Сер. биол. Наук. - 1970.- Вып. 1 — С. 12-16.);

6) (Мустафаева Г. А. Фитонцидотерапия хронических гнойных средних отитов (Клинико-Экспериментальное исследование): Автореф. Дис. … к. м. н. - Баку, 1969. - 21 с.);

7) (Остапчук И. Ф. Петрук В. Ф. Акимов Ю. А. и др. Значение фитотерапии эфирными маслами в оптимизации санаторно-климатического лечения больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких //Вопросы климатофизиологии, климатопатологии и климатотерапии (Ялта, 21-22 окт.1982 г.) Тез. Докл. Респ.науч. Конф. - Ялта: Таврия 1982 -С. 163-164;

8) (С.А. Артюшкин, П.В. Начаров, Г.В. Вержбидский, В.К. Артюшкина, Л.А. Гребенщикова Микрофлора наружного слухового прохода у больных бактериальными наружным диффузным отитом //Росотаринолар. -2012. -номер2(57) -с8992);

9) (Ahlem Ben Slima,Manel Ben Ali and Radhouane Gdoura, Antioxidant Properties of Pelargonium graveolens L’Her essential oil on the reproductive damage induced by deltamethrin in mice as cjmpared to alpha-tocopherol);

10) (Ebani, Nardoni, Bertelloni, University of Pisa, Italy, 2017);

11) (Kristinsson, Magnusdottir, Petersen, Hermansson, Landspitali University hospital, Iceland, 2005);

12) (Obtaining and characterization of a selective pelargonium graveolens l’hér. Dry extract with potential therapeutic activity in metabolic diseases alexandra filareta neagu, teodora costea, ioana nencu, ligia elena duţu, maria lidia popescu, octavian tudorel olaru, cerasela elena gîrd).