VIII Международный конкурс научно-исследовательских и творческих работ учащихся
Старт в науке
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ДВУХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКОВ К ИЗМЕНЕНИЮ рН РАСТВОРА
Автор работы награжден дипломом победителя I степени
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
СОКРАЩЕНИЯ
г – грамм
л - литр
мг – миллиграмм
мкг – микрограмм
мл - миллилитр
мкл - микролитр
нм - нанометр
BSA – бычий сывороточный альбумин
PBS – калий-фосфатный буфер
pH – водородный показатель
TEABS - триэтиламмоний-бикарбонатный буфер
Актуальность исследования
Белки (протеины) – это один из основных структурных компонентов живых организмов. С химической точки зрения, белки представляют собой биополимеры, структурной единицей которых являются аминокислоты (у человека их 20), соединенные друг с другом пептидными связями (Рис. 1, 2).
|
Рис. 1. Строение аминокислоты и образование пептидной связи в белке. |
Рис. 2. Аминокислоты, входящие в состав белков. |
|
Знание структуры и функции белков важно для изучения функций клеток, разработки новых лекарственных препаратов, диагностики заболеваний (например, количество и состав белков крови меняется при воспалении, инфекции, голодании). К числу методов химии белков относятся методы протеомики, основывающиеся на применении масс-спектрометрического анализа (анализ разделения ионизированных пептидов, полученных после расщепления белка, в электрическом и магнитном поле в соответствии с их массовым числом m/z – отношений массы к заряду иона пептида) и биоинформатики (определение вида белка на основе анализа больших баз данных) (Рис. 3). Зная протеом клетки или ткани, можно диагностировать заболевания и определять эффективность применяемого лечения. Чувствительность методов протеомики настолько высока, что можно определять до 10 тысяч разных белков в одном образце (Рис. 4).
|
Рис. 3 Принцип метода масс-спектрометрии при проведении протеомного анализа. |
Рис. 4 Чувствительность метода протеомного анализа в сравнении с «классическими» методами. |
Точный количественный анализ белка имеет важное значение для всех экспериментов, связанных с белками во множестве научно-исследовательских тем в области химии и биологии [1], в том числе при подготовке образцов к масс-спектрометрическому анализу. Для этих целей используют спектрофотометрическое измерение УФ-поглощения при 280 нм [2], анализ по Брэдфорду и анализ по Лоури.
Спектрофотометрия - физико-химический метод исследования веществ, который основан на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Применительно к анализу белков, спектрофотометрический метод основан на том, что ароматические аминокислоты тирозин и триптофан придают белку характерный УФ-спектр поглощения при 280 нм, который используется для оценки белка (диапазон концентраций: 0,1 – 100 мкг/мл). Фенилаланин и дисульфидные связи также способствуют поглощению на этой длине волны, правда, незначительно (Рис. 5).
Рис. 5. Типичный спектр поглощения белковой молекулы.
Анализ по Lowry (диапазон определяемых концентраций белка 10-1000 мкг/мл) основан на преобразовании Cu2+ в Cu1+ в щелочной среде и дальнейшем восстановлении хромогенных комплексов реактива Фолина. Эта реакция зависит от четырех аминокислотных остатков (цистеин, цистин, тирозин и триптофан), а также от структуры пептидных групп (Рис. 6). Преимуществом метода Лоури является его высокая чувствительность, а главное, точность. Однако многие соединения, обычно используемые в буферных растворах для приготовления белкового препарата (например, детергенты, углеводы, глицерин, трицин, ЭДТА, Трис) препятствуют анализу методом Лоури и образуют осадок [1]. Тем не менее, влияние этих веществ может быть уменьшено путем разбавления образца, но только тогда, когда концентрация белка достаточно высока [3]. Интенсивность окраски хромогена пропорциональна количеству цистеина, цистина, тирозина и триптофана [4].
|
Рис. 6. Принцип метода определения белков по Лоури. |
Рис. 7. Принцип метода определения белков по Брэдфорду. |
Анализ по Брэдфорду (диапазон определяемых концентраций белка: 20-2000 мкг/мл) основан на образовании комплекса между красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250 и белками в растворе. Свободный краситель существует в четырех различных ионных формах. Более анионные формы связываются с белками и имеют максимум подлощения (абсорбция) при 590 нм. Концентрация белка может быть оценена путем определения количества красителя в ионной форме и измерением оптической плотности раствора при 595 нм [5]. Краситель связывается с аргинином, триптофаном, тирозином, гистидином, фенилаланином белковых молекул [2] (Рис. 7).
|
Белки содержат кислые и основные аминокислоты, поэтому в их составе всегда имеются свободные кислые (СОО–) и основные (NH3+) группы (Рис. 8). Поэтому одним из факторов, влияющих на результаты количественного определения белков, является водородный показатель (pH) – отрицательный десятичный логарифм концентрации водородных ионов: pH = –lg [H+]. Концентрация ионов Н+ и ОН− в чистой воде при комнатной температуре всегда одинакова: [Н+] = 10–7 моль/л, [ОН–] = 10–7 моль/л. Водородный показатель pH < 7 указывает на кислую среду, pH > 7 соответствует щелочной среде, pH = 7 - нейтральной среде. Для сохранения стабильного уровня рН в организме существуют буферные системы, а в условиях эксперимента применяют буферные растворы, которые имеют определенную устойчивую концентрацию водородных ионов, поэтому рН практически не меняется при разбавлении, добавлении кислоты или основания. |
Рис. 8. Изменение заряда белковой молекулы при смещении значения рН среды. |
На биохимических форумах часто задаются вопросы, какой из распространенных методов определения концентрации белка лучше применять в той или иной ситуации, и зависят ли результаты метода Лоури или Брэдфорда от рН среды, однако однозначных исследований, выполненных в этом плане, нам не встречалось. Наряду с внушительными списками веществ, мешающих определению белка, упоминалось только, что сильные кислоты или основания интерферируют с анализом белка по Лоури [6].
Цель работы: выяснить, при каких оптимальных значениях рН будут работать методы определения количества белка по Лоури и Брэдфорду, и какой из этих методов будет лучше отражать суммарное содержание белка в сыворотке крови.
Задачи экспериментальной работы:
1. Определить фотоколориметрически оптическое поглощение (абсорбцию) стандартного раствора белка (бычьего сывороточного альбумина), обработанного по методу Брэдфорда и методу Лоури, при различных его концентрациях и при разных значениях кислотности среды.
2. Построить кривые зависимости оптического поглощения от концентрации при каждом значении рН.
3. Определить фотоколориметрически оптическое поглощение образца сыворотки крови здорового человека, обработанного параллельно со стандартом по методу Брэдфорда и методу Лоури при тех же значениях рН, что и стандарт.
4. С помощью соответствующих стандартных кривых для бычьего сывороточного альбумина (BSA) найти концентрацию белка в образце при каждом значении кислотности среды.
5. Сделать вывод о соответствии полученных экспериментальных данных и данных литературы, выбрать оптимальные условия для проведения каждого количественного метода и сопоставить данные двух методов по оптимальным условиям.
Химические основы выполняемых методов:
принцип метода Lowry в модификации Peterson
В основе метода лежат две реакции: 1) биуретовая реакция, где сульфат меди и тартрат меди в щелочном растворе образуют медно-белковые комплексы с пептидными группами белка; 2) когда добавляется реагент Folin-Ciocalteu, то он эффективно восстанавливается пропорционально этим хелатируемым медью комплексам, образуя водорастворимый продукт, синюю окраску которого можно измерить при 750 нм [6]. Предполагают, что ионы двухвалентной меди, комплексируясь с пептидными группами, облегчают перенос электронов (переходя из двухвалентного состояния Cu2+ в одновалентное Cu+ и обратно) от окисляемых фенольных (или других групп белка) на гексавалентные фосфомолибденовые-фосфовольфрамовые комплексы (в составе реагента Фолина) с понижением степени окисления атомов молибдена и вольфрама. На схеме в медно-белковом комплексе обозначены остатки аминокислот тирозина, триптофана, цистеина, гистидина как АК-остаткиred(тир, три, цис, гис) – исходная восстановленная форма с индексом red и АК-остаткиox(тир, три, цис, гис) – окисленная форма с индексом ox:
принцип метода Брэдфорда
Анионные формы молекул красителя Кумасси бриллиантового синего (G-форма), производящие синий цвет в кислой среде, электростатически связываются с азотсодержащими группами лизина, аргинина, гистидина на поверхности белков с образованием комплекса белок-краситель. Наличие плюс-заряженного центра в молекуле Кумасси (см. формулу ниже, Рис.9), очевидно, дает возможность электростатически связываться и с карбоксильными группами белков. Это стабилизирует в целом минус-заряженную форму красителя, концентрация которой коррелирует с концентрацией белка. Краситель не связывается пептидами с низкой молекулярной массой.
Рис.9 Формула красителя Кумасси бриллиантового синего (G-форма) и окраска его раствора
|
Материалы и реактивы: (Рис. 10) Сыворотка крови здорового человека Бычий сывороточный альбумин (порошок) Натрий, калий фосфатный буфер (PBS), рН 7,4. Готовится из таблетки по стандартному протоколу и хранится в холодильнике Триэтиламмоний-бикарбонатный буфер (TEABS), рН 8,5. Коммерческий реактив, хранится в холодильнике Маточные растворы бычьего сывороточного альбумина (BSA) с концентрацией 0,4 мг/мл. Один раствор готовить на деионизированной дистиллированной воде рН 6, второй - на PBS буфере рН 7,4, а третий – на TEABS буфере рН 8,5. Хранить в холодильнике или морозильной камере. Цветной реагент Кумасси бриллиантовый синий G-форма рабочий раствор. Готовить из коммерческого концентрата, разбавляя деионизированной дистиллированной водой в соотношении 1:4. Концентрат и рабочий раствор хранить при комнатной температуре. Лоури реагент. Готовить по протоколу производителя SIGMA и хранить при комнатной температуре. Фенольный реагент Фолина (Folin&Ciocalteu). Рабочую концентрацию готовят по протоколу производителя SIGMA, хранят при комнатной температуре. 96% этанол для промывки планшета Деионизированная дистиллированная вода. |
Рис. 10. Реактивы для выполнения работы. Рис. 11. Использование микропланшетного фотометра в работе. |
|
|
Оборудование: (Рис. 11) Микропипетки на 10, 50, 125, 250, 500 и 1000 мкл и наконечники к ним Пробирки типа Эппендорф на 1 и 2 мл и держатель для пробирок Пробирки полиэтиленовые с завинчивающимися крышечками на 10 мл Планшет 96-луночный Микропланшетный фотометр Anthos 2010 с программным обеспечением ADAP Аналитические весы Шприцы одноразовые на 2 и 5 мл Емкости для спирта и воды. |
||
Исследования выполнены с соблюдением правил безопасной работы в химической лаборатории.
Ход работы
Приготовить три разведения стандартного раствора белка BSA для каждой из трех серий согласно таблице 1. Серия I готовится из маточного раствора 0,4 мг/мл BSA на воде. Серия II готовится из маточного раствора 0,4 мг/мл BSA на PBS-буфере. Серия III готовится из маточного раствора 0,4 мг/мл BSA на TEABS-буфере.
Табл.1. Приготовление стандартных растворов BSA
|
Стандарт |
Серия I, pH6 |
Серия II, pH7,4 |
Серия III, pH8,5 |
|||||||
|
№ пробирки |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
|
мг/мл BSA |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
|
|
мл BSA-маточный |
0,25 |
0,5 |
1,0 |
0,25 |
0,5 |
1,0 |
0,25 |
0,5 |
1,0 |
|
|
мл H2O |
0,75 |
0,5 |
0 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
мл PBS |
- |
- |
- |
0,75 |
0,5 |
0 |
- |
- |
- |
|
|
мл TEABS |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
0,75 |
0,5 |
0 |
|
|
Всего мл в пробе |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
|
Развести сыворотку крови (образец) в 200 раз согласно таблице 2.
Таблица 2. Разведение сыворотки крови
|
Образец |
Серия I, pH6 |
Серия II, pH7,4 |
Серия III, pH8,5 |
|
№ пробирки |
10 |
11 |
12 |
|
мкл сыворотки |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
|
мкл H2O |
995,0 |
- |
- |
|
мкл PBS |
- |
995,0 |
- |
|
мл TEABS |
- |
- |
995,0 |
|
общий объем пробы, мл |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
Пипетировать каждую из 9 проб в три лунки планшета в соответствии с таблицей 3 по 10 мкл на обработку по методу Брэдфорда (строки A – D) и по 25 мкл на обработку по методу Лоури (строки E – H). Параллельно в лунки 10 – 12 загружаем соответствующие сериям реагенты для контроля (вода, PBS, TEABS): по 10 мкл на обработку по методу Бредфорда (строки A – C) и по 25 мкл на обработку по методу Лоури (строки E – G).
Обработать по Бредфорду: к содержимому в лунках (строки A – D) добавляем 200 мкл красителя Кумасси и хорошо перемешиваем. Через 5 мин измеряем оптическое поглощение.
Обработать по Лоури: к содержимому в лунках (строки E – H) добавляем 125 мкл реагента Лоури. Быстро и хорошо перемешиваем, инкубируем 20 минут при комнатной температуре, а затем добавляем 62,5 мкл реактива Фолина и опять сразу перемешиваем. Через 30 минут измеряем оптическое поглощение.
Таблица 3. Распределение проб по лункам планшета.
|
Стандарты и образцы* |
Контроль |
|||||||||||||||||||||||||
|
Проба/ Серия рН |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
||||||||||||||
|
A |
BSA |
I 6,0 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
H2O |
H2O |
H2O |
||||||||||||
|
B |
BSA |
II 7,4 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
PBS |
PBS |
PBS |
||||||||||||
|
C |
BSA |
III 8,5 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
TEABS |
TEABS |
TEABS |
||||||||||||
|
D |
Образец по Брэдфорду ( Все по 10 мкл) |
Серия I (H2O) |
Серия II (PBS) |
Серия III (TEABS) |
Все реагенты по 10 мкл |
|||||||||||||||||||||
|
- |
- |
- |
||||||||||||||||||||||||
|
E |
BSA |
I 6,0 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
H2O |
H2O |
H2O |
||||||||||||
|
F |
BSA |
II 7,4 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
PBS |
PBS |
PBS |
||||||||||||
|
G |
BSA |
III 8,5 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,4 |
0,4 |
0,4 |
TEABS |
TEABS |
TEABS |
||||||||||||
|
H |
Образец по Лоури ( Все по 25 мкл) |
Серия I (H2O) |
Серия II (PBS) |
Серия III (TEABS ) |
Все реагенты по 25 мкл |
|||||||||||||||||||||
|
- |
- |
- |
||||||||||||||||||||||||
* Значения в пробах 1-9 указывают концентрацию стандартного раствора BSA, мг/мл.
Примечание: в связи с особенностями используемого фотометра, все измерения абсорбции (оптической плотности) проводились на 620 нм.
Обработка показателей оптической плотности проб, а также построение самих стандартных кривых проводились в программе Excel.
Результаты и обсуждение экспериментов
В таблице 4 представлены результаты экспериментов. Для расчета концентрации общего белка в тестируемом образце на основе данных таблицы 4 строились кривые зависимости концентрации от оптической плотности стандартных растворов BSA (см. Приложение).
Таблица 4. Результаты эксперимента по определению белка методами
Бредфорда и Лоури
|
Метод |
Параметры |
Серии опытов** |
||||||||
|
I (pH6) |
II (pH 7,4) |
III (pH 8,5) |
||||||||
|
Стандарт*, мг/мл |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
0,1 |
0,2 |
0,4 |
|
|
Бредфорда |
Оптич.плотность |
|
|
|
|
|
0,422 |
|
|
|
|
Оптич.плотность |
|
|
|
|||||||
|
Концентрация образца (исходного), |
|
|
|
|||||||
|
Лоури |
Оптич.плотность |
|
|
|
|
|
|
0,026 |
0,009 |
|
|
Оптич.плотность |
0,371 |
0,217 |
0,028 |
|||||||
|
Концентрация образца (исходного), |
120,1 |
72,054 |
41,012 |
|||||||
* В качестве стандарта использовался бычий сывороточный альбумин (BSA)
** Пробы I серии готовились на воде (их pH 6)
** Пробы II серии готовились на солевом фосфатном буфере (их pH 7,4)
** Пробы III серии готовились на тетраэтиламмонийбикарбонатном буфере (TEABS pH 8,5)
Во всех пробах III серии метода Лоури после добавления реагента Лоури (содержащего сульфат меди, йодид калия и тартрат натрия в щелочном натрий карбонатном буфере) наблюдалось сильное помутнение белого цвета, которое после добавления реагента Фолина (содержащего фосфомолибденовый/фосфовольфрамовый комплексы следующих структур: 3H2O•P2O5•13WO3•5MoO3•10H2O и 3H2O•P2O5•14WO3•4MoO3•10H2O с максимальной степенью окисления атомов вольфрама и молибдена) чуть просветлилось. Это отразилось на высокой оптической плотности всех проб, в том числе контроля (проба, в которой отсутствовал белок, но был буфер TEABS pH 8,5). Высокая оптическая плотность контроля после добавления реагента Лоури может свидетельствовать о том, что щелочная среда буфера TEABS нарушает стабилизацию катионов меди Cu2+, находящейся в комплексе с тартратом (соль винной кислоты) и приводит к появлению труднорастворимого гидроксида меди Cu(OH)2 белого цвета. Поэтому результаты во всех пробах серии III в методе Лоури вызывают сомнения и не подлежат обсуждению. Что касается других серий, исполненных методом Лоури, то хороший результат дает серия II, где концентрация общего белка сыворотки крови здорового человека составляет норму (70 мг/мл, по данным литературы). Серия же I показывает значительно большие концентрация белка (выше нормы). Возможно, дело в белке, который при разном значении рН имеет разную конформацию и разный доступ ионов меди к пептидным связям. Нельзя исключить зависимость изменения редокс-потенциала сопряженных редокс-пар, таких как АКox/ АКred, Cu2+/Cu+ и Mo+6/Mo+4 или Wo+6/Wo+4 от кислотности среды. Процесс стабилизации ионов меди в тартратном комплексе (или пептидном комплексе) зависит от рН. При меньшем значении рН прочность хелатного комплекса нарушается, что подтверждается контролем, значение оптической плотности которого при рН 6 меньше, чем при рН 7,4. Итак, при определении белка методом Лоури оптимальным является рН 7,4.
Метод Брэдфорда (реагент - Кумасси бриллиантовый синий) показал неодинаковую концентрацию белка в трех сериях: в сериях I и III – в пределах нормы (60-85 мг/мл), а в серии II – чуть ниже нормы. Причина различий могла бы быть связана с изменением заряда частицы реагента (Рис. 9) в зависимости от pH среды. Однако, по литературным данным, при pH >2 реагент Кумасси существует в виде аниона. Таким образом, во всех сериях реагент Кумасси имеет минус-заряд. Такая форма сорбируется плюс-заряженными группами (лизина, аргинина, гистидина) на поверхности белка. Поскольку число плюс-заряженных групп белка зависит от pH-среды, то различия в концентрациях белка в 3 сериях могли бы объясняться различиями в числе плюс-заряженных групп лизина, аргинина, гистидина. Число таких групп при рН 6 больше, чем при рН 7,4. Этим можно объяснить более высокую концентрацию белка, хотя и попадающую в норму, при рН 6 (серия I) по сравнению с рН 7,4 (серия II). Однако при рН 8,5 азотсодержащие группы белка будут депротонированы (деионизированы), а поверхность белка будет нести отрицательный заряд за счет ионизации карбоксильных групп. На такой поверхности отрицательно заряженная форма Кумасси не сможет адсорбироваться. Почему же метод Брэдфорда дает повышенную концентрацию белка в серии III? Видимо, в щелочной среде наступает частичная/полная денатурация белка, что разворачивает его структуру и делает доступным его гидрофобные группы (аланин, валин, лейцин) для гидрофобного взаимодействия с ароматическими кольцами Кумасси. Исходя из данных, заключаем, что в методе Брэдфорда оптимальным является рН 6,0
В целом, проведенное исследование создало основу для выбора оптимального метода пробоподготовки при проведении следующего этапа исследования – масс-спектрометрической идентификации белков сыворотки крови для решения задач медицинской протеомики.
Выводы:
Метод Лоури и метод Брэдфорда дают разные значения концентрации белка в тестируемом образце в зависимости от pH.
Оптимальным условием для метода Брэдфорда является pH 6,0, а для метода Лоури – pH 7,4 (здесь получаем наилучший результат).
В этих условиях оба метода дают примерно одинаковые значения концентрации белка в тестируемом образце сыворотки крови, соответствующие литературным данным.
Используемая литература
Johnson M., ПереводК. Якимчук. Количественное определение белка MATER METHODS ru 2012;2:115
Olson B, Markwell J. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Protein Sci. 2007;0: Unit 3.4
Zhao H, Zhang J, Lu J, He X, Chen C, Li X, et al. Reduced expression of N-Myc downstream-regulated gene 2 in human thyroid cancer. BMC Cancer. 2008;8:303
Евсельева Е. А., Симонян Е. В., Шумакова Н. А. Использование метода Лоури для количественного определения белка в альбумине // Медицина: вызовы сегодняшнего дня: материалы Междунар. науч. конф. (г. Челябинск, июнь 2012 г.). — Челябинск: Два комсомольца, 2012. — С. 90-92. — URL https://moluch.ru/conf/med/archive/52/2379/
Waterborg J, Matthews H. The Lowry method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 1984;1:1-3
Протоколыон-лайн Pierce Biotechnology www.thermoscientific.com/pierce
Замятнин А.А. Протеомика //»Биология». № 14, 2005 г.
Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология, Москва, 2000 г.
В работе использованы иллюстрации:
http://biokhimija.ru/lekcii-po-biohimii/13-belki/13-fiziko-himicheskie-svojstva-belkov.html
https://ru.wikipedia.org/wiki
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1150380/ и http://slideplayer.com/slide/8717548/
http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch04s06.html
http://microamaze.blogspot.ru/2015/07/protein-estimation-by-folin-lowrys.html
https://www.news-medical.net/whitepaper/20160218/Standard-Curve-Generation-for-Colorimetric-Assay-in-the-Kinetic-or-Basic-Eppendorf-BioSpectrometerc2ae.aspx
http://biokhimija.ru/lekcii-po-biohimii/13-belki/13-fiziko-himicheskie-svojstva-belkov.html
Приложение
Рис.1П.
Рис.2П.
Рис.3П.
Рис.4П.
Рис.5П.
Рис.6П.